Dokument: Struktur und Dynamik der N-terminalen Domäne des nicht-strukturellen Proteins 3 (NSP3) von SARS-CoV-2, untersucht mittels NMR-Spektroskopie und ergänzender biophysikalischer Methoden
| Titel: | Struktur und Dynamik der N-terminalen Domäne des nicht-strukturellen Proteins 3 (NSP3) von SARS-CoV-2, untersucht mittels NMR-Spektroskopie und ergänzender biophysikalischer Methoden | |||||||
| Weiterer Titel: | Structure and Dynamics of the N-terminal Domain of the SARS-CoV-2 Non-Structural Protein 3 (NSP3) Investigated by NMR Spectroscopy and Complementary Biophysical Methods | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=71820 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20260107-105924-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Vormann, Katharina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Lakomek, Nils-Alexander [Gutachter] Dr. Hoyer, Wolfgang [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | SARS-CoV-2, COVID-19 | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursachte eine der größten Pandemien der jüngeren Geschichte. Obwohl rasch entwickelte Impfstrategien zur Eindämmung der Pandemie beitragen konnten, fehlt es weiterhin an wirksamen antiviralen Therapien, auch zur Behandlung von Post-COVID-Symptomen. Ziel des Promotionsprojektes war es, ein tiefergehendes Verständnis der grundlegenden Komponenten der viralen Replikationsmaschinerie zu gewinnen. Dies soll langfristig zur Entwicklung verbesserter antiviraler Behandlungsstrategien beitragen. SARS-CoV-2 ist für die Replikation seiner viralen RNA auf Doppelmembranvesikel angewiesen. Das nicht-strukturelle Protein 3 (NSP3) ist eine Schlüsselkomponente des viralen Replikations-Transkriptions-Komplexes (RTC) sowie Bestandteil der DMV-Pore. In dieser Arbeit werden einzelne Domänen von NSP3 – die Ubiquitin-ähnlichen Domänen 1 und 2 (Ubl1 und Ubl2) sowie die Papaon-ähnliche Protease (PLpro) – untersucht, um virale Replikationsmechanismen besser zu verstehen. Als Nebenprojekt wurden zudem Struktur und Dynamik neuronaler SNARE-Proteine (SNAP25 und Synaptobrevin-2) analysiert, die an der Fusion synaptischer Vesikel beteiligt sind und die Vesikelplastizität beeinflussen. Für alle Zielproteine wurden biochemische Expressions- und Reinigungsprotokolle entwickelt und etabliert, die strukturelle Untersuchungen mittels Kernspinresonanz-(NMR)-Spektroskopie, Zirkulardichroismus-Spektroskopie, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und analytischer Ultrazentrifugation ermöglichten. Eine integrative, NMR-basierte Pipeline wurde entwickelt, um AlphaFold3-Strukturmodelle zu validieren und flexible Proteinregionen zu analysieren. Anhand der N-terminalen NSP3-Domäne Ubl1 als Modellsystem konnte die vorhergesagte β-Grasp-Faltung bestätigt werden. Interessanterweise, wurde mittels NMR ein hochdynamischer N-Terminus (ca. 15 Aminosäuren) detektiert, der in Kristall- oder Kryo-Elektronenmikroskopie-Strukturen nicht sichtbar ist. NMR-Relaxationsmessungen und sekundäre chemische Verschiebungen charakterisierten dessen flexible Natur. Weitere Analysen zeigten, dass Ubl1 unter physiologischen Bedingungen monomer vorliegt, jedoch eine salzabhängige Modulation der Dynamik sowie eine schwache, reversible Selbstassoziation aufweist, was auf eine funktionelle Anpassung an dicht gepackte intrazelluläre Umgebungen hindeutet. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation zeigten eine cytosolische Verteilung von Ubl1 in HEK293T-Zellen, was mit seiner Orientierung an der cytosolischen Seite der DMV-Pore übereinstimmt. Posttranslationale Modifikationen wurden mittels Massenspektrometrie und elektrophoretischer Methoden charakterisiert. Ubl1 wurde sowohl in bakteriellen als auch in humanen Expressionssystemen phosphoryliert, was seine Ladung verändert und möglicherweise RNA- oder Proteininteraktionen moduliert. NMR-spektroskopische Untersuchungen zeigten eine zufällige, bedingungsabhängige Bindung von Ubl1 an virale einzelsträngige RNA (ssRNA), ohne klar definierte Bindestelle. Auch die Ubl2-Subdomäne von PLpro wurde mittels NMR untersucht, wobei frühere Zuordnungen erweitert und die Ubiquitin-ähnliche Faltung bestätigt wurden. Für PLpro führten optimierte Expressions- und Rückfaltungsprotokolle zur Gewinnung löslichen Proteins, das für Hochfeld-NMR-Studien geeignet ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit neue strukturelle und biophysikalische Erkenntnisse über zentrale Domänen von SARS-CoV-2 sowie Wirtsproteinen, die an der Vesikeldynamik beteiligt sind. Sie etabliert ein Rahmenkonzept zur Validierung KI-generierter Strukturmodelle und zur Untersuchung dynamischer Proteinregionen und trägt damit zu einem besseren Verständnis der Coronavirus-Replikation und der Virus-Wirt-Interaktionen bei.Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) caused one of the largest pandemics in recent history. While rapidly developed vaccination schemes could help contain the pandemic, effective antiviral treatment, including for post-COVID symptoms, remains lacking. In this doctoral project, we aimed for deeper insights into the basic components of the viral replication machinery. This will eventually contribute to improved antiviral treatment strategies. SARS-CoV-2 relies on double-membrane vesicles (DMVs) for viral RNA replication. Non-structural protein 3 (NSP3) is a key component of the viral replication-transcription complex (RTC) and the DMV-spanning pore. This thesis investigates individual NSP3 domains - the ubiquitin-like domains 1 and 2 (Ubl1 and Ubl2) and the papain-like protease (PLpro) - to better understand viral replication. As a side project, the structure and dynamics of neuronal SNARE proteins (SNAP25 and Synaptobrevin-2), which are involved in synaptic vesicle fusion and affect vesicle plasticity, were also investigated. Biochemical expression and purification protocols were developed and established for all target proteins, enabling structural studies using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, circular dichroism spectroscopy, small-angle X-ray scattering, and analytical ultracentrifugation. An integrative NMR-based pipeline was developed to validate AlphaFold3 structural models and analyze flexible regions. Using the N-terminal NSP3 domain Ubl1 as a model system, the predicted β-grasp fold was confirmed. Notably, NMR revealed a highly dynamic N-terminal segment (~15 residues) invisible in crystal or cryo-electron microscopy structures. NMR relaxation and secondary chemical shift data characterized its flexible nature. Further analyses showed that Ubl1 remains monomeric under physiological conditions but displays salt-dependent modulation of dynamics and weak reversible self-association, suggesting functional adaptation to crowded intracellular environments. Subcellular localization studies revealed cytosolic positioning of Ubl1 in HEK293T cells, aligning with its orientation at the cytosolic face of the DMV pore. Post-translational modifications were characterized using mass spectrometry and electrophoretic techniques. Ubl1 was phosphorylated in both bacterial and human systems, affecting its charge and possibly modulating RNA or protein interactions. NMR spectroscopy indicated random, condition-dependent binding of Ubl1 to viral ssRNA, without a defined binding site. The Ubl2 subdomain of PLpro was also studied by NMR, extending previous assignments and confirming its ubiquitin-like fold. For PLpro, optimized expression and refolding protocols yielded soluble protein suitable for high-field NMR studies. Overall, this work provides new structural and biophysical insights into key domains of SARS-CoV-2 and host proteins involved in vesicle dynamics. It establishes a framework for validating AI-generated models and studying dynamic protein regions, contributing to our understanding of coronavirus replication and viral-host interactions. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » NMR - Spektroskopie biologischer Makromoleküle | |||||||
| Dokument erstellt am: | 07.01.2026 | |||||||
| Dateien geändert am: | 07.01.2026 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 12.11.0025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.12.0025 |
