Dokument: HIV-Restriktionsfaktor-APOBEC3C-Varianten fusioniert mit Cas9 zeigen base editing Aktivität

Titel:	HIV-Restriktionsfaktor-APOBEC3C-Varianten fusioniert mit Cas9 zeigen base editing Aktivität
Weiterer Titel:	HIV-restriction factor APOBEC3C variants fused to Cas9 show single base editing activity
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=71790
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20260114-111754-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Chiapella, Catherina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,81 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 31.12.2025 / geändert 31.12.2025
Beitragende:	Prof. Dr. Münk, Carsten [Gutachter] Prof. Dr. Drexler, Ingo [Gutachter]
Stichwörter:	HIV-restriction factor, APOBEC3, base editing
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Humane APOBEC3 (A3) repräsentieren eine Proteinfamilie aus sieben Cytidin-Desaminasen, A3A-D, F-H. Es handelt sich hierbei um Restriktionsfaktoren des angeborenen Immunsystems, die den Wirt vor einer Infektion mit Retroviren und DNA-Viren schützen sollen: Durch die Desaminierung von Desoxy-Cytidin (dC)-Resten zu Desoxy-Uridin (dU)-Resten des viralen Genoms, werden Hypermutationen eingefügt, die zu einer reduzierten Integration der retroviralen DNA in das Wirtsgenom führen und somit die Virusreplikation hemmen. Aufgrund ihrer katalytischen Aktivität als Desaminase, werden A3-Proteine auch im Zusammenhang mit Base Editing (BE), einer Weiterentwicklung der CRISPR-Cas9-Methode, angewandt. Im Gegensatz zur herkömmlichen CRISPR-Cas9-Methode, die auf DNADoppelstrangbrüchen basiert, fügen BE Komplexe Punktmutationen durch Desaminasen ein. Uracil-Glykosylase-Inhibitoren (UGI) und enzymatisch deaktiviertes Cas9 (nCas9) ermöglichen den Erhalt der Punktmutation. Zur Erkennung des Editierungsziels innerhalb der DNA wird eine single guide RNA (sgRNA) benötigt. Innerhalb der A3-Proteinfamilie werden besonders A3A, A3B und A3G für BE genutzt, humanes A3C (huA3C) zeigte hingegen bis jetzt nur geringe Effizienz. Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs verschiedene BE Komplexe mitels eines fluoreszenz-basierten Echtzeit-Reporter-Assays getestet. Der A3A-Komplex diente als positive Kontrolle, bei den restlichen fünf BE Konstrukten handelte es sich um huA3C und davon abgeleitete Varianten. Ziel war es einen effizienten A3CBE Komplex zu identifizieren und charakterisieren. Hierfür wurden zunächst HEK293T Zellen mit den BE Komplexen, einer sgRNA und dem Reporter Plasmid transfiziert. BE Aktivität konnte sowohl mikroskopisch als auch mitels Durchflusszytometrie beobachtet werden. A3C Chimär 2 (A3C CH2) zeigte hohe Effizienz im Rahmen dieser Experimente, die restlichen vier A3C Desaminasen hingegen nur geringe bis keine BE Aktivität. Bei A3C CH2 handelt es sich um einen Chimär aus huA3C mit Sooty mangabey A3C (smmA3C)-like. Die ersten 37 Aminosäuren stimmen mit smmA3C-like überein, die restlichen Aminosäuren stammen von huA3C. Es wurden verschiedene Theorien aufgestellt, um die hohe BE Effizienz von A3C CH2 zu erklären. Fehlerhafte Proteinfaltung der anderen Varianten, Unterschiede der intrazellulären Lokalisierung oder eine stärkere Affinität zu nCas9 des A3C CH2 wurden diskutiert. Es konnten im Rahmen dieser Experimente keine signifikanten Unterschiede zwischen den A3C BE Komplexen nachgewiesen werden. Human APOBEC3 (A3) represents a seven-member protein family of cytidine deaminases, A3AD, F-H. The A3 enzymes are part of the innate immune system and represent restriction factors protecting the host from retroviral infection: through the deamination of cytidine (dC) to uridin (dU) residues within the viral genome, point mutations are inserted. Said mutations ultimately lead to the destabilization of the genetuc material and thereby restrict virus replication. Due to their catalytic activity as deaminases, A3 proteins are applied in the context of base editing (BE), which was derived from the CRISPR-Cas9 method. In contrast to the conventional CRISPR-Cas9, which requires DNA double-strand breaks, BE complexes introduce point mutations through deamination. Uracil glycosylase inhibitors (UGI) and enzymatically deactivated Cas9 (Cas9n) ensure that the point mutation is maintained. Similar to CRISPR-Cas9, BE requires a single guide RNA in order to recognize the DNA target. Currently, of the A3 protein family, A3A, A3B and A3G are most commonly used for BE. Human A3C (huA3C) has so far shown low editing efficiency. A panel of six different base editors carrying A3 variants was created for this study. The A3A base editor served as a positive control. The remaining five BE complexes included huA3C and four A3C variants. Base editors were subsequently submited to a fluorescence-based real-time reporter assay to test for BE activity. The aim was to identify an efficient A3C base editor and to characterize the A3C variant in its role as base editor. HEK293T cells were transiently transfected with the BE complexes, a sgRNA, and the reporter plasmid. BE activity could be observed both microscopically and through flow cytometry. While variant A3C Chimera 2 (A3C CH2) showed high efficiency, the remaining four A3C deaminases showed low to no BE efficiency. A3C CH2 is a chimera of huA3C with sooty mangabey A3C (smmA3C)-like. The first 37 amino acid residues match with smmA3C-like, whereas the remaining residues of the enzyme are derived from huA3C. Various theories surged to explain why A3C CH2 in particular showed high editing frequencies, including deviant protein folding of the other variants, differences in intracellular localization, and a stronger affinity ofCas9 to A3C CH2. However, no significant differences were observed between the A3C base editors within these experiments. Subsequent experiments focused on identifying the amino acid residues that contributed to A3C CH2s increased BE efficiency. Loop1 and αHelix1 regions of A3 deaminases are crucial for their enzymatic activity. Therefore, additional variants of huA3C and A3C CH2 with mutations in Loop1 and αHelix1 regions were created. The variants were then subjected to the fluorescence-based real-time reporter assay. A gain-of-function of huA3C was achieved after receiving the αHelix1 of A3C CH2 and Loop1 amino acid residues tyrosine and glycine at positions 28 and 29 (28YG29). The detailed characterization of deaminases for BE contributes to ongoing efforts to improve this promising gene editing tool.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	14.01.2026
Dateien geändert am:	14.01.2026
Promotionsantrag am:	15.07.2025
Datum der Promotion:	27.11.2025