Dokument: Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen dem CD95-Rezeptor und seinem Liganden mittels multiparametrischer Bildspektroskopie und Superresolutionsmikroskopie
| Titel: | Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen dem CD95-Rezeptor und seinem Liganden mittels multiparametrischer Bildspektroskopie und Superresolutionsmikroskopie | |||||||
| Weiterer Titel: | Probing CD95 Receptor and Ligand Interactions with Multiparametric Image Spectroscopy and Superresolution Microscopy | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=71690 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20251216-112054-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Shang, Xiaoyue [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Monzel, Cornelia [Gutachter] Prof. Dr. Seidel, Claus [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 530 Physik | |||||||
| Beschreibungen: | Mitglieder der TNFRSF/TNFSF-Superfamilie zeigten großes Potenzial in der Entwicklung von Krebsimmuntherapien. CD95/CD95L, ein klassisches Mitglied der TNFRSF/TNFSF-Familie, ist jedoch hinsichtlich seines Signalwegs und seiner Stöchiometrie bei der Apoptoseinduktion noch nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Studie konzentrierte ich mich auf zwei Ziele: i) die Bestimmung der Stöchiometrie von membranständigem CD95 nach Bindung von CD95L-Varianten (IZ-CD95L oder Flag-CD95L) mithilfe der HeLa-Wildtyp-Zelllinie; ii) das Verständnis der Interaktionen der extrazellulären Domäne (ECD) von CD95 in vitro.
Zu diesem Zweck habe ich zunächst erfolgreich sowohl den CD95-Rezeptor als auch das IZ-CD95L-Protein für biomedizinische und anschließend biotechnologische Assays designt und hergestellt. IZ-CD95L wurde in der HEK293T-Zelllinie exprimiert und anschließend modifiziert. Ich verifizierte die biologische Aktivität von IZ-CD95L mittels Apoptosedynamikanalyse und verglich systematisch seine Zytotoxizität mit der von Flag-CD95L, mit und ohne Vernetzung durch einen Anti-Flag-mAb, bei verschiedenen Konzentrationen. Die Ergebnisse zeigen, dass IZ-CD95L bei einer Konzentration von 1000 ng/ml eine bessere Leistung als Flag-CD95L aufwies. Dies wurde durch Oberflächenplasmonenresonanzmessungen weiter bestätigt. Um die Stöchiometrie von Membran-CD95 aus molekularer Sicht zu interpretieren, wurde STED-Imaging durchgeführt. Ich konnte die STED-Färbung und die Bilddatenanalyse optimieren. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass CD95 als Monomer/Dimer vorliegt. Nach Ligandenbindung bilden CD95/CD95L Monomere/Trimere und Dimere/Trimere anstelle höherer Oligomere, was die zuvor vorgeschlagenen hexagonalen CD95-Konfigurationen in der HeLa-Wildtyp-Zelllinie ausschließt. Im zweiten Schritt untersuchte ich die Wechselwirkungen und Abstände der extrazellulären Domäne (ECD) von CD95 auf einer DNA-Origami-Nanoplattform. Die extrazelluläre Domäne (ECD) von CD95 wurde in vivo biotinyliert, indem ein BirA-Plasmid mit dem CD95-ECD-Konstrukt in einer E. coli-Zelllinie kotransformiert wurde. Das Protein wurde erfolgreich mit ATTO 643 und ATTO 594 mittels NHS-Ester-Markierung am N-Terminus markiert, wobei Markierungsgrade von 1,12 bzw. 1,22 erreicht wurden. Ich koppelte ein CD95/Streptavidin/DNA-Origami-Konstrukt für die FRET-Nanoskopie. Das DNA-Origami wurde mit einem FRET-starken Farbstoffpaar markiert und als Positivkontrolle verwendet; es zeigten detektierbare FRET-Ereignisse. Mit CD95/Streptavidin/DNA-Origami-Konstrukten wurde jedoch kein signifikanter FRET-Effekt detektiert. Durch die Verwendung eines echten FRET-Farbstoffpaares als positive Sonde entwickelte und optimierte ich ein Protokoll zur Probenpräparation, FRET-Nanoskopie-Datenerfassung und Bilddatenanalyse. Ich stellte fest, dass im Fall von CD95/Streptavidin/DNA-Origami zwar FRET detektiert werden kann, jedoch nicht in der erwarteten Stärke. Zur Bestätigung dieses Befundes sind weitere Kontrollen erforderlich, darunter die Verbesserung des Datenanalyse-Codes, die Ausrichtung des Abberior-STED-Mikroskops und die Optimierung der Markierungseffizienz. Da FRET nur in seltenen Fällen nachgewiesen wird, können wir die Bildung stabiler CD95-Dimere ausschließen; vielmehr ist von einer geringen Häufigkeit oder einer vorübergehenden Interaktion zwischen CD95-Rezeptorpaaren auszugehen.TNFRSF/TNFSF superfamily members showed great potential in recent cancer immunotherapies development. CD95/CD95L as a classic member of TNFRSF/TNFSF, however their signaling pathway and stoichiometry upon apoptosis initiation has not been solved yet. In this study, I focused on two goals: i) interpreting the stoichiometry of membrane CD95 upon CD95L variants (IZ-CD95L or Flag-CD95L) binding using Hela WT cell line; ii) understanding of CD95 extracellular domain (ECD) interactions in vitro. To this end, I first successfully designed and produced both CD95 receptor and IZ-CD95L protein to be used in biomedical and afterwards biotechnological assays. IZ-CD95L was expressed using HEK293T cell line and modified afterward. I verified biological activity of IZ-CD95L using apoptosis dynamics analysis and systematically compared its cytotoxicity with Flag-CD95L with or without anti-Flag mAb crosslinking at varying concentrations. The result shows that at 1000 ng/ml, IZ-CD95L showed better performance than Flag-CD95L. This is further tested by surface plasmon resonance measurement. To interpret the stoichiometry of membrane CD95 from a molecular perspective, STED imaging was performed. I have been able to perform and improve STED staining and imaging data analysis. From these experiments, CD95 was identified as pre-existing monomer/dimers. Upon ligand triggering, CD95/CD95L form monomers/trimers and dimers/trimers rather than higher oligomers, excluding the previously proposed hexagonal CD95 configurations in Hela WT cell line. Secondly, I aimed at CD95 ECD interactions and spacing on DNA origami nanoplatform. CD95 ECD was in vivo biotinylated using co-transformation of BirA plasmid with CD95 ECD construct using E.coli cell line. The protein was successfully labelled with ATTO 643 and ATTO 594 using NHS ester N-terminus labelling and degrees of labelling were achieved with 1.12 and 1.22 respectively. I coupled CD95/streptavidin/DNA origami construct for FRET nanoscopy. The DNA origami was labelled with a high FRET pair and was used as positive control and showed detected FRET events. However, no significant FRET was detected using CD95/streptavidin/DNA origami constructs. By using true FRET pair as a positive probe, I performed and improved a protocol of sample preparation, FRET nanoscopy data acquisition and imaging data analysis. I figured out that in the case of CD95/streptavidin/DNA origami, FRET can be detected but not as expected sufficiently high. Further controls need to be for verification of this finding including, data analysis code improvement, Abberior STED microscope alignment and labeling efficiency improvement. Since FRET is detected only in rare cases, we can exclude the formation of stable CD95 dimers, but rather have a low fraction or transient interaction between CD95 receptor pairs. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Physik » Experimentalphysik | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.12.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.12.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 15.07.2025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 09.12.2025 |
