Dokument: In-vitro-Expression mit unnatürlichen Aminosäuren – Ein Werkzeug zur ortsspezifischen Photovernetzung von Membranproteinen

Titel:	In-vitro-Expression mit unnatürlichen Aminosäuren – Ein Werkzeug zur ortsspezifischen Photovernetzung von Membranproteinen
Weiterer Titel:	In-vitro expression with unnatural amino acids -A tool for site-directed photocrosslinking of membrane proteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=71523
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20251124-142038-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Xiao, Yajing [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,35 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.11.2025 / geändert 24.11.2025
Beitragende:	Prof.Dr. Labahn, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. rer. nat. Heise, Henrike [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Zusammenfassung Das In-vitro-Proteinexpressionssystem (CFPS) dient als robuste Methode zur Proteinsynthese in einer offenen und zugänglichen Umgebung. Die Nutzung der genetischen Code-Expansion (GCE) durch das orthogonale tRNA/tRNA-Synthetase-System unter Einbeziehung nichtnatürlicher Aminosäuren (UAAs) ermöglicht die Untersuchung von Proteininteraktionen durch Photovernetzung. Peter G. Schultz nutzte diesen GCE-Ansatz, um p-Benzoyl-L-phenylalanin und p-Azido-L-phenylalanin in sjGST einzubauen und erreichte dabei eine Photovernetzungseffizienz von etwa 30 %. Diese relativ geringe Effizienz wird auf die Konkurrenz zwischen Release Factor 1 und der orthogonalen tRNA um das Amber-Codon zurückgeführt. Die Verwendung eines Release Factor 1 (RF1)-defizienten Stammes macht die CFPS-Plattform zu einem effektiven Werkzeug für den Einbau von UAAs in Zielproteine. Das aus dem RF1-defizienten Stamm B95.ΔA gewonnene CFPS erhöhte die Photovernetzungseffizienz. Um UAAs in das Membranprotein PS1 einzubauen, wurden zunächst die für die Herstellung des S30-Lysats relevanten Faktoren untersucht. Optimale Bedingungen hierfür sind die Kultivierung der Zellen in 2xYTPG-Medium, die Ernte von T7-RNAP-überexprimierten B95.ΔA-Zellen vor der frühen logarithmischen Phase (OD600 ~ 2,5), das einmalige Aufbrechen der Zellen bei niedrigem Druck (700 bar mit Microfluidics M-110P) und die Dialyse des rohen S30-Lysats über Nacht bei 37 °C. Darüber hinaus mussten drei Komponenten des CFPS im Batch-Modus optimiert werden: Die optimalen Bedingungen waren 85 ng/μl T7-RNAP, 12 mM Mg2+ und 170 mM K+, was etwa 100 ng/μl EGFP ergab. Die Zugabe von 1 μM BpA-RS, 1 μM BpA-tRNA und 1 mM BpA zum CFPS war für den Einbau von UAAs in Zielmembranproteine signifikant. Insgesamt kann das etablierte CFPS im Batch-Modus 57,4 ng/μl PS1-N190X liefern. Anschließend wurde das lösliche Protein sjGST photovernetzt. Dabei zeigte sich, dass die Photovernetzungseffizienz nahezu 100 % betrug, sobald die Bestrahlungszeit 45 Minuten überschritt und der Beleuchtungsabstand zwischen der 96-Well-Platte und der UV-Quelle bei Verwendung der Photonenquelle etwa 2 cm betrug. Verschiedene hydrophobe Empfänger zur Solubilisierung des Membranproteins PS1, wie Liposomen, CHAPSO-destabilisierte Liposomen, Sulfo-DIBMA-DMPC-Nanodiscs und MSP-2N2-DMPC-Nanodiscs, wurden verwendet, um die native Umgebung nachzubilden. Die korrekte Konformation von PS1-N190X und PEN2 wurde indirekt durch die Selbstaktivierung des PS1-N190X/PEN2/MSP-2N2-DMPC-Nanodisc-Komplexes bestätigt. Nach 90-minütiger Bestrahlung von selbstaktiviertem (gespaltenem) PS1/PEN2 in Gegenwart von MSP-2N2-DMPC-Nanodiscs im etablierten CFPS wurden die PS1-N190X-Bänder in voller Länge wiederhergestellt, was zeigt, dass die NTF- und CTF-Fragmente von PS1 vernetzt waren. Summary The in vitro protein expression system (CFPS) serves as a robust methodology for synthesizing proteins in an open and accessible environment. The utilization of Genetic Code Expansion (GCE) through the orthogonal tRNA/tRNA-synthetase system incorporating unnatural amino acids (UAAs) enables the study of protein interactions by photocrosslinking. Peter G. Schultz employed this GCE approach to incorporate p-benzoyl-L-phenylalanine and p-azido-L-phenylalanine into sjGST, achieving a photocrosslinking efficiency of approximately 30%. This relatively low efficiency is attributed to the competition between release factor 1 and the orthogonal tRNA to the amber codon. The use of a release factor 1 (RF1)-deficient strain leverages the CFPS platform to be an effective tool for the incorporation of UAAs into target proteins. The CFPS derived from the RF1-deficient strain B95.ΔA increased the photocrosslinking efficiency. To incorporate UAAs into the membrane protein PS1, first of all, the factors relevant for the preparation of S30 lysate were studied, whose optimum conditions are culturing cells in 2xYTPG medium; harvesting T7 RNAP-overexpressed B95.ΔA cells before the early-logarithmic phase (OD600 ~ 2.5); disrupting cells only once under lower pressure (700 bar with Microfluidics M-110P); and overnight dialyzing the crude S30 lysate at 37℃. Furthermore, three components of the CFPS in batch mode had to be optimized: The optimal conditions were 85 ng/μl T7 RNAP, 12mM Mg2+, and 170 mM K+, yielding around 100 ng/μl EGFP. By addition of 1 μM BpA-RS, 1 μM BpA-tRNA, and 1 mM BpA into the CFPS was significant in incorporating UAAs into target membrane proteins. Overall, the established CFPS can yield 57.4 ng/μl PS1-N190X in batch mode. Subsequently, photocrosslinking was used on the soluble protein sjGST, which showed that the photocrosslinking efficiency was nearly 100% once the irradiation time exceeded 45 minutes and the illumination distance was approximately 2 cm between the 96-well plate and the UV source when using the photon source. Various hydrophobic receivers for solubilization of the membrane protein PS1, such as liposomes, CHAPSO-destabilized liposomes, Sulfo-DIBMA-DMPC nanodiscs, and MSP-2N2-DMPC nanodiscs, were used to mimic the native environment. The right conformation of PS1-N190X and PEN2 was confirmed indirectly by the self-activation of the PS1-N190X/PEN2/MSP-2N2-DMPC nanodiscs complex. After the 90-minute irradiation of self-activated (cleaved) PS1/PEN2 in the presence of MSP-2N2-DMPC nanodiscs in the established CFPS. The full-length PS1-N190X bands were recovered, thereby showing that the NTF- and CTF- fragments of PS1 were crosslinked.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	24.11.2025
Dateien geändert am:	24.11.2025
Promotionsantrag am:	06.11.2025
Datum der Promotion:	20.11.2025