Dokument: Kinetische Modellierung des Glutamattransports und der Anionenkanalfunktion von vesikulären Glutamattransportern
| Titel: | Kinetische Modellierung des Glutamattransports und der Anionenkanalfunktion von vesikulären Glutamattransportern | |||||||
| Weiterer Titel: | Kinetic modelling of glutamate transport and anion channel function of vesicular glutamate transporters | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=71313 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20251209-122209-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Borghans, Bart [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Christoph Fahlke [Gutachter] Prof. Dr. Christine R. Rose [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Vesikuläre Glutamattransporter beladen synaptische Vesikel mit Glutamat und spielen eine Schlüsselrolle in der neuronalen Signalübertragung. In dieser Arbeit wurde die Funktion dieser Transporter mit einer Kombination aus zellulärer Elektrophysiologie und kinetischer Modellierung beschrieben. Ein mutanter Transporter mit erhöhter Plasmamembranexpression durch Neutralisierung der zellulären Zielsequenz (VGLUT1PM) wurde in HEK293T-Zellen heterolog exprimiert und mit Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie charakterisiert. VGLUTs können mehrere Transportfunktionen vermitteln. Sie sind nicht nur sekundär-aktive H+-Glutamat-Austauscher, sondern auch Cl− Kanäle. Diese Transportfunktionen sind bei unterschiedlichen Spannungen sowie externen pH und Cl−-Konzentrationen analysiert. Der Cl−-Kanal wurde mit geschlossenen und offenen Zuständen simuliert, die entweder nicht, einfach oder doppelt protoniert sind und entweder einen Cl− Liganden binden oder nicht. Dieses Modell beschreibt alle experimentellen Befunde, insbesondere die Aktivierung und Deaktivierung durch Spannungssprünge oder Änderungen in pH und [Cl−]. Kinetische Analysen zeigen, dass gebundenes Cl− die erste Protonierung von VGLUT1 allosterisch erleichtert und den offenen Kanal stabilisiert, hauptsächlich im einfach protonierten Zustand. Histidin 120 scheint eine wichtige Rolle dabei zu spielen, wie allosterisches Cl− die Kanalöffnung fördert, was den stationären Strom und die Aktivierungsrate bei pH- und Spannungssprüngen erhöht. Neutralisierung dieser Aminosäure führt zu erhöhten Cl−-Dissoziationsraten und weniger Öffnungen durch einfache Protonierung. H120A VGLUT1PM aktiviert vorwiegend im doppelt protonierten Zustand. Der Transport von Glutamat und Aspartat wurde mit einem alternierenden Zugangsmechanismus simuliert, der die doppelte Protonierung zur Bindung eines Substrats erfordert. Der Übergang von der inneren zur äußeren Konformation mit gebundenem Glutamat ist, solange kein Proton dissoziiert ist, vernachlässigbar und passiert nur im einfach protonierten Zustand. Nach der Translokation dissoziiert Glutamat nach einer erneuten Protonierung auf der luminalen Membranseite. Cl− aktiviert den Glutamattransport allosterisch durch Erhöhung der Glutamat-Bindungsraten und erleichtert den Übergang im Transportzyklus. Nach Bindung von Aspartat verhindert ein hoher pKa-Wert die zytoplasmatische Deprotonierung und Aspartat transloziert im doppelt protonierten Zustand. Die unterschiedliche Protonierung während Glutamat- und Aspartattransport führt zum H+-Glutamat-Austausch und zum Aspartat-Uniport.Vesicular glutamate transporters load glutamate into synaptic vesicles and play an integral role in neuronal signal transduction. This work describes the function of these transporters with a combination of cellular electrophysiology and kinetic modelling. A mutant transporter with increased plasma membrane expression, generated by the neutralisation of its cellular targeting sequence (VGLUT1PM), was heterologously expressed in HEK293T cells and characterised with whole-cell patch clamp electrophysiology. VGLUTs have multiple transport modes. They function not only as secondary active H+-glutamate exchangers but also as Cl− channels. These transport functions were analysed at different voltages as well as at external pH and Cl− concentrations. The Cl− channel was simulated with open and closed states that are either not, singly, or doubly protonated and can all additionally bind a Cl− ligand. This model describes all experimental results, especially the activation and deactivation of voltage jumps or changes in pH and [Cl−]. Kinetic analyses show that bound Cl− supports the first protonation of VGLUT1 allosterically and stabilises the open channel, primarily when it is singly protonated. Histidine 120 appears to play an important role in the way allosteric Cl− promotes channel opening, which increases steady-state current and the activation rate during pH- and voltage jumps. Neutralisation of this amino acid causes increased Cl− dissociation rates and reduces opening under single protonation. H120A VGLUT1PM mostly opens from doubly protonated states. The transport of glutamate and aspartate was simulated with an alternating access mechanism that requires double protonation for substrate binding. The transition from the inward- to the outward-facing conformation with glutamate bound is negligible as long as no proton dissociates and occurs only in the singly protonated state. After the translocation, glutamate dissociates only after re-protonation on the luminal side of the membrane. Cl− allosterically activates the transport of glutamate by increasing the glutamate binding rates and supports transitions in the transport cycles. An increase in the pKa prevents cytoplasmic deprotonation after aspartate is bound, which causes it to be translocated in the doubly protonated state. The difference in protonation between glutamate and aspartate transport leads to H+-glutamate exchange and to the uniport of aspartate. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.12.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 09.12.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 05.11.2024 | |||||||
| Datum der Promotion: | 21.10.2025 |
