Dokument: Dual Modulation of Chikungunya Virus nsP2 Protease: Peptide-Mediated Inhibition and Nucleic Acid-Induced Activation

Titel:	Dual Modulation of Chikungunya Virus nsP2 Protease: Peptide-Mediated Inhibition and Nucleic Acid-Induced Activation
Weiterer Titel:	Duale Modulation der Chikungunya-Virus-nsP2-Protease: Peptid-vermittelte Inhibition und Nukleinsäure-induzierte Aktivierung
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70977
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20251016-111922-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mastalipour, Mohammadamin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 25,25 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.10.2025 / geändert 13.10.2025
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Apl. Prof. Dr. Dingley, Andrew [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Climate change favors the proliferation and spread of arthropod-borne viruses (arboviruses) around the globe. Chikungunya virus (CHIKV) is a re-emerging arbovirus from the genus Alphavirus, which is mainly transmitted by Aedes species mosquitoes. Due to climate change, the vector is now present in various regions, including the Americas, Africa, Europe, and Asia, and causes a rapid increase in CHIKV infections. The first approved vaccine was introduced against CHIKV in 2023. However, the vaccine has its limitations and is not beneficial for individuals already infected. This highlights the need for treatment against CHIKV. CHIKV is a positive-sense, single-stranded RNA virus, whose replication depends on the cleavage of the nonstructural polyprotein P1234 by the protease activity of non-structural protein 2 (nsP2pro). In addition to its essential role in viral replication, nsP2pro is also involved in the downregulation of the host immune response, including suppression of the interferon response and disruption of major histocompatibility complex class I (MHC-I). The crucial role of nsP2pro in viral replication makes it a promising target for the development of antiviral therapies. In order to identify potential inhibitors against CHIKV nsP2pro, two distinct approaches, including a phage display technique and the screening of animal venom-based peptides, were employed. Through phage display four peptides were identified with the potential to inhibit nsP2pro. Biochemical analysis showed that peptide P1 had the strongest inhibitory effect among the four peptides, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 4.6 ± 1.9 μM. Further in vitro and in silico studies revealed that peptide P1 has low cytotoxicity up to 100 μM and acts as a competitive inhibitor with micromolar-range affinity. The second potential candidate is pantinin-1, a peptide derived from the scorpion Pandinus imperator, with a broad antimicrobial spectrum. Inhibition assays demonstrated that pantinin-1 is capable of inhibiting the catalytic activity of nsP2pro with an IC50 value of 6.4 ± 2.04 μM and complete inhibition at a concentration of 175 μM. Various predictions with three docking programs (Galaxy TongDock, ClusPro, and HDock) showed that pantinin-1 interacts with the protease active site. However, some models predicted binding at a site opposite to the active site of nsP2pro. In contrast, inhibition mode assay showed that pantinin-1 decreases the Michaelis-Menten constant (km) without affecting the reaction velocity, which is characteristic of a competitive inhibitor. The cell cytotoxicity assay revealed that pantinin-1 has no toxic effects at concentrations around three times higher than its IC50; however, toxicity was observed at concentrations of 40 μM and higher. Nucleic acids are an important factor influencing viral protein activity. Various studies have shown that certain viral proteins can interact with nucleic acids (DNA or RNA) from either the viral genome or the host cell. These interactions can affect the structure, stability, and function of viral proteins, particularly those involved in replication and assembly. In some cases, such interactions can enhance viral protease activity, which in turn impacts viral replication and host infection. Based on this knowledge, The effects of different nucleic acids, including single- and double-stranded DNA, selected DNA aptamers through high-throughput sequencingfluorescent ligand interaction profiling, and random nucleic acids, was evaluated on CHIKV nsP2pro activity. The analysis showed that both specifically selected and non-specific singlestranded nucleic acids enhance the activity of the protease. Moreover, it was shown that double-stranded DNA could not enhance protease activity. Additionally, the enhancement depends on buffer composition. At high salt concentration (400 mM NaCl), no enhancement in activity occurred. The molecular docking results predicted that single-stranded nucleic acids likely bind at the methyltransferase domain of the nsP2pro. Finally, the effect of the singlestranded nucleic acids on the inhibitory effect of peptide P1 was evaluated. It was shown that in the presence of single-stranded nucleic acids, the inhibitory effect of peptide P1 decreased. This suggests a potential modulatory role of nucleic acids that should be taken into account when developing inhibitors against CHIKV nsP2pro. However, further in-depth studies are necessary to confirm Der Klimawandel begünstigt die Vermehrung und weltweite Ausbreitung von Arthropodenübertragenen Viren (Arboviren). Das Chikungunya-Virus (CHIKV) ist ein wiederauftretendes Arbovirus aus der Gattung Alphavirus und wird hauptsächlich durch Stechmücken der Gattung Aedes übertragen. Aufgrund veränderter klimatischer Bedingungen haben sich diese Vektoren mittlerweile in verschiedenen Regionen etabliert, darunter Amerika, Afrika, Europa und Asien, was zu einem raschen Anstieg von CHIKV-Infektionen führt. Im Jahr 2023 wurde der erste zugelassene Impfstoff gegen CHIKV eingeführt. Dieser Impfstoff weist jedoch Einschränkungen auf und ist für bereits infizierte Personen nicht wirksam, was die Notwendigkeit antiviraler Behandlungsstrategien unterstreicht. CHIKV ist ein RNA-Virus mit einzel- und positivsträngigem Erbgut, dessen Replikation von der Spaltung des nichtstrukturellen Polyproteins P1234 durch die Proteaseaktivität des nichtstrukturellen Proteins 2 (nsP2pro) abhängt. Neben seiner zentralen Rolle in der viralen Replikation ist nsP2pro auch an der Umgehung der Immunantwort beteiligt, unter anderem durch die Suppression der Interferon-Antwort und die Störung der Expression des Haupthistokompatibilitätskomplexes Klasse I (MHC-I). Aufgrund seiner Schlüsselrolle stellt nsP2pro ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung antiviraler Wirkstoffe dar. Zur Identifikation potenzieller Inhibitoren von CHIKV nsP2pro wurden zwei komplementäre Ansätze verfolgt: ein phage display technology sowie die Untersuchung von Peptiden tierischen Ursprungs. Das phage display identifizierte vier Peptide mit potenziell inhibitorischer Wirkung auf nsP2pro. Unter diesen zeigte Peptid P1 die stärkste Hemmwirkung mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50) von 4,6 ± 1,9 μM. Weitere in vitro- und in silico-Analysen zeigten, dass P1 bis zu einer Konzentration von 100 μM eine geringe Zytotoxizität aufweist und als kompetitiver Inhibitor mit mikromolarer Affinität wirkt. Ein zweiter vielversprechender Kandidat ist Pantinin-1, ein Peptid aus dem Skorpion Pandinus imperator, das ein breites antimikrobielles Spektrum aufweist. Enzymatische Hemmtests zeigten, dass Pantinin-1 die Aktivität von nsP2pro mit einer IC50 von 6,4 ± 2,04 μM hemmt; bei einer Konzentration von 175 μM wurde eine vollständige Inhibition beobachtet. Molekulare Docking- Studien mit drei Programmen (GalaxyTongDock, ClusPro und HDOCK) ergaben, dass Pantinin-1 vermutlich an der aktiven Stelle der Protease bindet; einige Modelle deuteten jedoch auch auf eine alternative Bindung gegenüber der aktiven Stelle hin. Im Gegensatz dazu zeigte die kinetische Analyse, dass Pantinin-1 den Michaelis-Konstanten (Km) senkt, ohne die Reaktionsgeschwindigkeit zu beeinflussen - ein typisches Merkmal kompetitiver Inhibitoren. Zytotoxizitätsanalysen zeigten, dass Pantinin-1 bis zum Dreifachen seiner IC50 keine toxischen Effekte aufweist, jedoch ab einer Konzentration von 40 μM eine Toxizität erkennbar ist. Nukleinsäuren stellen einen wichtigen Faktor dar, der die Aktivität viraler Proteine beeinflussen kann. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass bestimmte virale Proteine mit Nukleinsäuren (DNA oder RNA) aus dem viralen Genom oder der Wirtszelle interagieren können. Diese Interaktionen können die Struktur, Stabilität und Funktion viraler Proteine beeinflussen, insbesondere solcher, die an der Replikation und Assemblierung beteiligt sind. In einigen Fällen können diese Wechselwirkungen die Aktivität viraler Proteasen steigern und somit die virale Replikation sowie die Infektion von Wirtszellen fördern. Auf Grundlage dieser Erkenntnisse wurde der Einfluss verschiedener Nukleinsäuren - darunter Einzel- und Doppelstrang-DNA, selektierte DNA-Aptamere (identifiziert mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung und fluoreszenzbasierter Liganden-Interaktions-Analyse) sowie zufällige Nukleinsäuren - auf die Aktivität von CHIKV nsP2pro untersucht. Die Analyse zeigte, dass sowohl spezifisch selektierte als auch unspezifische einzelsträngige Nukleinsäuren die Proteaseaktivität steigern können, während Doppelstrang-DNA diesen Effekt nicht zeigte. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Aktivitätssteigerung vom Puffer abhängig ist: Bei hoher Salzkonzentration (400 mM NaCl) war keine Aktivitätssteigerung nachweisbar. Molekulare Docking-Analysen deuten darauf hin, dass einzelsträngige Nukleinsäuren wahrscheinlich an die Methyltransferase-Domäne von nsP2pro binden. Abschließend wurde der Einfluss einzelsträngiger Nukleinsäuren auf die inhibitorische Wirkung von Peptid P1 untersucht. Es zeigte sich, dass in Anwesenheit dieser Nukleinsäuren die Hemmwirkung von P1 reduziert war. Dies weist auf eine mögliche modulierende Rolle von Nukleinsäuren hin, die bei der Entwicklung von Inhibitoren gegen CHIKV nsP2pro berücksichtigt werden sollte. Dennoch sind weiterführende, vertiefte Studien erforderlich, um diese Beobachtung zu bestätigen und zu klären, ob dieser Effekt allgemein übertragbar ist.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	16.10.2025
Dateien geändert am:	16.10.2025
Promotionsantrag am:	26.08.2025
Datum der Promotion:	10.10.2025