Dokument: Development of a full-thickness skin model with stably integrated immunocompetent cells and a prediction model for skin sensitization

Titel:	Development of a full-thickness skin model with stably integrated immunocompetent cells and a prediction model for skin sensitization
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70964
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20251106-144927-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Böttcher, Patricia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 19,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.10.2025 / geändert 12.10.2025
Beitragende:	Prof. Dr. Dr. h. c. Stark, Holger [Gutachter] Prof. Dr. Breitkreutz, Jörg [Gutachter] Dr. Mewes, Karsten R. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	In the last decades, there has been a significant shift towards animal-free experiments in scientific research. It has been driven by a range of factors, including ethical concerns, as outlined in the 3R principle published by Russel and Burch in 1959. This publication emphasized the ethical guidelines for animal research: to replace, reduce and refine the use of animals. In alignment with the principles, the movement has been reinforced by regulatory frameworks, e.g., the ban of testing final cosmetic products on animals by the European Commission (Article 18, No 1233/2009). Additionally, the limitation and differences between animal models and human biology highlight the need for alternative methods. As a result, the demand to develop new in vitro test methods has increased even further. The aim of this project is to develop a physiologically relevant immunocompetent skin model with integrated dendritic cells that represent the immune responses within the skin, with specific emphasis on allergic reactions. To generate cells that closely resembles Langerhans cells (LCs), the dendritic cells of the skin, MUTZ-3 cells were differentiated into MUTZ-LCs which are commonly used as LC surrogates. Hereby, various differentiation media were tested to optimize the differentiation protocol, especially the standardization. For that, two undefined medium supplements were tested that are recommended by the Leibniz-Institute DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) to maintain MUTZ-3 cells: 5637-conditioned medium (5637CM) and fetal calf serum (FCS). The differentiation of the cells was morphologically as well as phenotypically analyzed by documenting the structural characteristics and the expression of specific markers, e.g., CD207 and CD1a. The results demonstrated that 5637CM has no positive impact on the MUTZ-LC differentiation, as the expression of pivotal proteins remained unchanged. In addition, when reducing FCS percentage by 75 %, the desired differentiation status was already achieved after 7 instead of 14 days of culture in the majority of cells. As a side project, it was tested whether FCS can be replaced with the commercially available FCS alternative Ultroser G. However, the differentiation with FCS was more successful than with Ultroser G. Furthermore, the immunocompetence of the MUTZ-LCs was studied, as it is a prerequisite for their intended role in an immunocompetent skin model. The treatment with the sensitizer DNCB resulted in the upregulation of CD83, a marker for activated LCs, as well as the characteristic morphological changes, the detachment of MUTZ-LCs. However, this could not be detected after NiSO4 treatment, another tested sensitizer. As a subsequent step, the successful integration of MUTZ-LCs into the Phenion® Full-Thickness skin model was achieved. The structural integrity of the skin models was confirmed by optical coherence tomography images and hematoxylin-eosin staining of tissue sections. Furthermore, the precise localization of the MUTZ-LCs was demonstrated through immunofluorescence staining. Finally, the immunocompetence of the skin models with integrated MUTZ-LCs was tested by treating the skin models with the sensitizers DNCB and NiSO4. It could be demonstrated that hydrocortisone, which is originally supplemented to the Phenion® Full-Thickness skin model culture medium, hinders the migration of MUTZ-LCs from the epidermis into the dermis after sensitizer treatment. Further experiments need to be conducted to validate the immunocompetence of the skin model and to establish a new accepted method to assess the sensitization potential of chemicals. Such a model would be an important test method to demonstrate the skin tolerability of cosmetic products. In den letzten Jahrzehnten hat sich die wissenschaftliche Forschung zunehmend von Tierexperimenten abgewandt und vermehrt alternative Methoden entwickelt. Dieser Wandel wurde durch eine Reihe von Faktoren vorangetrieben, darunter ethische Bedenken, wie sie in dem von Russel und Burch veröffentlichten 3R-Prinzip dargelegt wurden (1959). In dieser Veröffentlichung wurden die ethischen Leitlinien für die Tierforschung definiert: das Ersetzen, Reduzieren und Verfeinern des Einsatzes von Tieren. Im Einklang mit diesen Grundsätzen wurde die Bewegung durch rechtliche Rahmenbedingungen verstärkt, z. B. durch die Europäische Kommission, die Tierversuche für die Testung kosmetischer Endprodukte verboten hat (Artikel 18, Nr. 1233/2009). Darüber hinaus untermauern die Unterschiede von Tiermodellen und der menschlichen Biologie die Notwendigkeit von alternativen Methoden. Aus den genannten Gründen ist die Nachfrage nach neuen In-vitro-Testmethoden weiter steigend. Das Ziel des Projektes ist die Entwicklung eines physiologisch relevanten immunkompetenten Hautmodells mit integrierten Dendritischen Zellen, welches die Immunreaktionen der Haut repräsentiert, mit dem Schwerpunkt auf allergische Reaktionen. Um Zellen zu generieren, die den Dendritischen Zellen der Haut, den Langerhans Zellen (LC), ähneln, wurden MUTZ-3 Zellen zu MUTZ-LCs differenziert. Diese Zellen werden häufig als LC-Surrogate verwendet. Zunächst wurden verschiedene Differenzierungsmedien getestet, um besonders die Standardisierbarkeit des Differenzierungsprotokolls zu verbessern. Dafür wurden zwei undefinierte Mediumzusätze getestet, die von dem Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) für die MUTZ-3 Zellkultur empfohlen werden: 5637-konditioniertes Medium (5637CM) und fetales Kälberserum (FCS). Die Differenzierung der Zellen wurde morphologisch sowie phänotypisch analysiert, indem die strukturellen Merkmale und die Expression spezifischer Marker, wie beispielsweise CD207 und CD1a, dokumentiert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass 5637CM keine positive Auswirkung auf die MUTZ-LC Differenzierung hat, da die Expression von Schlüsselproteinen unverändert blieb. Durch die Reduzierung des FCS-Gehalts um 75 % wurde der gewünschte Differenzierungsstatus in den meisten Zellen bereits nach 7 statt 14 Tagen erreicht. Als Nebenprojekt wurde außerdem getestet, ob FCS komplett durch die kommerziell verfügbare FCS Alternative Ultroser G ersetztet werden kann. Jedoch war die Differenzierung mit FCS erfolgreicher als mit Ultroser G. Des Weiteren wurde die Immunkompetenz der MUTZ-LCs überprüft, da diese Eigenschaft eine Voraussetzung für ihre beabsichtigte Rolle im immunkompetenten Hautmodell ist. Die Behandlung mit dem Sensibilisator DNCB resultierte in die Hochregulierung von CD83, einem Marker für aktivierte LCs, sowie die charakteristischen morphologischen Veränderungen, wie die Ablösung der MUTZ-LCs. Dies konnte jedoch nicht nach der Behandlung mit NiSO4, einem weiteren Sensibilisator, festgestellt werden. Im nächsten Schritt wurde die erfolgreiche Integration der MUTZ-LCs in das Phenion® Vollhautmodell erreicht. Die strukturelle Integrität des Hautmodells wurde durch Bilder der optischen Kohärenztomographie und Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Gewebsschnitten bestätigt. Zudem erfolgte die Lokalisation der MUTZ-LCs mittels Immunfluoreszenzfärbungen. Schließlich wurde die Immunkompetenz der Hautmodelle mit integrierten MUTZ-LCs getestet, indem die Modelle mit den Sensibilisatoren DNCB und NiSO4 behandelt wurden. Es konnte nachgewiesen werden, dass Hydrokortison, das ursprünglich dem Phenion® Vollhautmodell-Kulturmedium hinzugefügt wurde, die Migration der MUTZ-LCs von der Epidermis in die Dermis beeinträchtigt beziehungsweise verhindert. Für eine Validierung der Immunkompetenz des Hautmodells sowie der Etablierung einer akzeptierten in vitro Methode zur Prüfung des Sensibilisierungspotenzials von Chemikalien müssen jedoch weitere Experimente durchgeführt werden. Ein solches Modell wäre eine wichtige Testmethode, um die Hautverträglichkeit von kosmetischen Mitteln nachzuweisen.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	06.11.2025
Dateien geändert am:	06.11.2025
Promotionsantrag am:	20.03.2025
Datum der Promotion:	19.09.2025