Dokument: Strukturelle Untersuchungen an membranassoziierten Proteinen: NMR-Strukturen des HIV-1 Virus Protein U (39-81) und des humanen CD4 (372-433)

Titel:	Strukturelle Untersuchungen an membranassoziierten Proteinen: NMR-Strukturen des HIV-1 Virus Protein U (39-81) und des humanen CD4 (372-433)
Weiterer Titel:	Structural studies of membrane-associated proteins: NMR structures of HIV-1 virus protein U (39-81) and human CD4 (372-433)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=7086
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20081007-155659-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Wittlich, Marc [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 27,34 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.03.2008 / geändert 07.03.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Büldt, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Sticht, Heinrich [Gutachter]
Stichwörter:	NMR, HIV, CD4, VpU, Membranprotein, Proteinreinigung
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Transmembranglycoprotein CD4 (cluster determinant 4) spielt eine wichtige Rolle bei der adaptiven Immunabwehr. CD4 wird vornehmlich auf der Oberfläche von T-Helferzellen präsentiert, aber ebenso auf einer Teilmenge von Gedächtnis- und regulatorischen T-Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen. Die Bindung der lymphozytenspezifischen Kinase p56LcK an die zytoplasmatische Domäne des CD4 ist entscheidend für die Antigenrezeptor-vermittelte Signaltransduktion. Das humane Immundefizienz-Virus (HIV) nutzt CD4 als primären Rezeptor zur T-Zell-Invasion. Das Virus hat vielfache Strategien entwickelt, um das CD4 von infizierten Zellen herunterzuregulieren. Das HIV-1 Protein U (VpU) ist ein akzessorisches Protein, das für die Verstärkung der Viruspartikelfreisetzung und die Herunterregulierung des CD4 verantwortlich ist. Die physikalische Wechselwirkung der viralen Proteine Nef und VpU mit der zytoplasmatischen Domäne des CD4 initiiert eine Kaskade von Ereignissen, die zur Degradation des CD4 führt. Die Phosphorylierung der Serine 53 und 57 im VpU spielt eine entscheidende Rolle bei der Herunterregulierung des CD4. Das Ziel dieser Arbeit war die Klonierung und Produktion der interagierenden Fragmente des humanen CD4 und des HIV-1 VpU, ebenso ihre strukturelle und dynamische Charakterisierung mittels NMR-, CD-spektroskopischer und molekularbiologischer Methoden. Da die beschriebene Wechselwirkung zwischen CD4 und VpU in direkter Nähe zur Membran des Endoplasmatischen Retikulums stattfindet, wurden nahezu alle Experimente in Anwesenheit von Modellmembransystemen durchgeführt. Um sicherzustellen, dass die Komplexbindung zwischen CD4 und seinen Liganden (z.B. VpU, Nef, p56LcK) in vitro in direkter Membrannähe stattfindet, wurde das CD4 mit seiner Transmembrandomäne in der Membran verankert. CD4 ist ein Molekül mit einem Gewicht von 58 kDa. Es besteht aus einer extrazellulären Domäne von 370 Aminosäuren, einer kurzen Transmembranregion, und einer zytoplasmatischen Domäne von 40 Aminosäuren am C-terminalen Ende. In dieser Arbeit wurde die Struktur der 62 C-terminalen Residuen des CD4, welche die Transmembran und zytoplasmatischen Domänen beinhalten, untersucht. Ein für die CD4-Aminosäuren 372 bis 433 kodierendes, synthetisches Gen wurde kloniert; die heterologe Expression und die Reinigung wurden durchgeführt. Die Inkorporation des rekombinanten Wildtyp-CD4tmcyt-Fragmentes in Lipidmembranen und die physikalische Wechselwirkung mit der zytoplasmatischen Domäne des VpU (VpUcyt) wurde mit Hilfe eines Zentrifugationsassays, gefolgt durch Reversed Phase Chromatographie-Analyse der Proteoliposomenzusammensetzung, gezeigt. Circular Dichroismus (CD)-Spektroskopie an CD4tmcyt in Dodecylphosphocholin (DPC)-Mizellen zeigte einen Gehalt an alpha-Helix von etwa 40%. Hochaufgelöste NMR-Spektren von 13C/15N-markiertem CD4tmcyt-Peptid in membransimulierenden DPC-Mizellen beweisen, dass Flüssig-NMR-Studien an diesem CD4-Fragment und seinen molekularen Komplexen möglich sind. Zur einfacheren Handhabung wurde eine Cystein-freie Variante des CD4tmcyt konstruiert (CD4mut). Die fünf Cystein-Residuen der zytoplasmatischen Domäne des CD4tmcyt wurden gegen Serin- bzw. Histidin-Residuen im CD4mut-Polypeptid ausgetauscht. Uniform 13C und 15N markiertes Protein wurde rekombinant in E. coli exprimiert und danach aufgereinigt. Die funktionelle Bindungsaktivität des CD4mut an das VpUcyt wurde bestätigt, der Kd dieses Komplexes wurde mit 250 μM oder stärker bemessen. Nahezu vollständige NMR-Resonanzzuordnung der 1H-, 13C-, and 15N-Spins des CD4mut wurde erreicht. Die Sekundärstruktur des CD4mut in membran-simulierenden DPC-Mizellen wurde mit Hilfe der sekundären chemischen Verschiebungen, NOE-abgeleiteten Proton-Proton-Abständen und CD-Spektroskopie ermittelt. Es wurden eine stabile Transmembranhelix, sowie eine kurze amphipatische Helix in der zytoplasmatischen Domäne identifiziert. Die fraktionale Helizität der zytoplasmatischen Helix scheint in Anwesenheit von DPC-Mizellen stabilisiert zu sein, obwohl ihre Ausdehnung im Vergleich zu vorherigen Studien an synthetischen Peptiden verringert ist. Das 81 Aminosäuren lange Transmembranprotein VpU besteht aus einer Transmembrandomäne von 21 Aminosäuren, einem kurzen Abschnitt basischer Residuen und einer sauren zytoplasmatischen Domäne von 42 Aminosäuren. In dieser Arbeit wurde die zytoplasmatische Domäne exprimiert, gereinigt und in An- und Abwesenheit von DPC-Mizellen mittels NMR- und CD-spektroskopischer Methoden analysiert. Zusätzlich wurden die strukturellen Auswirkungen der Phosphorylierung von zwei Serinen im VpUcyt untersucht. Während das VpUcyt in wässriger Lösung nahezu unstrukturiert vorliegt, so kommt es durch Zugabe von DPC-Mizellen zur Formation einer signifikanten alpha-helikalen Sekundärstruktur. Es konnten eine amphipatische Helix einschliesslich der Residuen I39 bis E48 (Helix 2) und eine zweite Helix einschliesslich der Residuen L64 bis R70 (Helix 3) ermittelt werden, die sich in Rigidität und Helizität unterscheiden. Zusätzlich konnten weitere helikale Windungen in der interhelikalen Region und dem C-Terminus festgestellt werden. Ausserdem konnte eine teritäre Faltung aus den NOE-abgeleiteten Distanz-einschränkungen abgeleitet werden, die Helix 2 und 3 in antiparalleler Konformation zeigt, während die interhelikale Region und der C-Terminus oberhalb der Helix-Helix-Ebene in Kontakt miteinander stehen. Durch die Phosphorylierung der Serine 53 und 57 scheint die Gesamtstruktur des VpUcyt unverändert zu sein, während die Rigidität der interhelikalen Region zuzunehmen und mit einer geringfügigen N-terminalen Erweiterung von Helix 3 und einer C-terminalen Schwächung von Helix 2 einherzugehen scheint. The transmembrane glycoprotein CD4 (cluster determinant 4) plays a prominent role in the adaptive immune response. CD4 is displayed primarily on the surface of T helper cells, but also on subsets of memory and regulatory T lymphocytes. Binding of the lymphocyte specific tyrosine kinase p56LcK to the cytoplasmic domain of CD4 is crucial for antigen receptor-mediated signal transduction. The human immunodeficiency virus (HIV) utilizes CD4 as the main receptor for T-cell invasion. The virus has developed multiple strategies for down-regulation of CD4 in infected cells. The HIV-1 protein U (VpU) is an accessory protein responsible for enhancement of virus particle release and downregulation of CD4. Physical interactions of viral proteins VpU and Nef with the cytoplasmic tail of CD4 initiate a cascade of events leading to degradation of CD4. Phosphorylation of serines 53 and 57 of VpU plays an essential role in CD4 downregulation. Aim of this work was the cloning and production of the interacting fragments of human CD4 and HIV-1 VpU, as well as their structural and dynamical characterisation using NMR-, CD-spectroscopical and molecular biology methods. As the specified interaction of CD4 and VpU takes place close to the membrane of the endoplasmic reticulum, most observations were performed in presence of model membrane systems. To insure in vitro complex binding between CD4 and ligands (e.g. VpU, Nef, p56lck) in direct membrane proximity, CD4 was decided to be membrane-anchored with its transmembrane domain. CD4 is a protein of 58 kDa. It consists of an extracellular domain of 370 amino acids, a short transmembrane region, and a cytoplasmic domain of 40 amino acids at the C-terminal end. We investigated the structure of the 62 C-terminal residues of CD4, comprising its transmembrane and cytoplasmic domains. A synthetic gene encoding CD4 amino acid residues 372 to 433 was cloned; heterologous expression and purification of the CD4 fragment was carried out. The incorporation of the recombinant wild-type CD4tmcyt fragment in lipid membranes and physical interaction with the cytoplasmic domain of VpU (VpUcyt) was demonstrated by centrifugation assays followed by reversed phase chromatographic analysis of the composition of the proteoliposomes. Circular dichroism (CD) spectroscopy of CD4tmcyt in dodecylphosphocholine (DPC) micelles yields about 40% alpha-helical content. High resolution NMR spectra of uniformly 13C/15N-labeled CD4tmcyt peptide in membrane simulating DPC micelles proves the possibility of solution NMR studies of this CD4 fragment and its molecular complexes. For easier handling, a cystein-free variant of CD4tmcyt was constructed (CD4mut). The five cysteine residues of the cytoplasmic region have been replaced with serine and histidine residues in the polypeptide CD4mut. Uniformly 15N and 13C labeled protein was recombinantly expressed in E. coli and purified. Functional binding activity of CD4mut to protein VpUcyt was verified, the Kd of this complex was estimated to be 250 μM or lower. Close to complete NMR resonance assignment of the 1H, 13C, and 15N spins of CD4mut was accomplished. The secondary structure of CD4mut in membrane simulating DPC micelles was characterized based on secondary chemical shift analysis, NOE-based proton-proton distances, and circular dichroism spectroscopy. A stable transmembrane helix and a short amphipathic helix in the cytoplasmic region were identified. The fractional helicity of the cytoplasmic helix appears to be stabilized in the presence of DPC micelles, although the extension of this helix is reduced in comparison to previous studies on synthetic peptides in aequous solution. The 81-residue transmembrane protein VpU consists of a transmembrane domain of 21 amino acids, a short stretch of basic amino acids, and an acidic cytoplasmic domain of 42 amino acids. We studied the cytoplasmic domain in presence and absence of membrane-mimicking micelles, respectively, using NMR- and CD-spectroscopical methods. Additionally, structural consequences of phosphorylation of two serine residues in VpUcyt were examined. As VpUcyt is largely unstructured in aequous buffer, a significant amount of alpha-helical secondary structure is observed upon addition of DPC micelles. An amphipatic helix comprising residues I39 to E48 (helix 2) and a second helix comprising residues L64 to R70 (helix 3) are derived, differing in rigidity and helicity. Additional helical turns are detected in the loop region between the helices and at the C-terminus. Furthermore, a tertiary fold is derived from NOE distance constraints showing helices 2 and 3 in antiparallel conformation, while the interhelical region and the C-terminus contact well above the helix-helix plane. Upon phosphorylation of Ser53 and Ser57, overall structure of VpUcyt seems unchanged, while the rigidity in the interhelical region seems to increase concomitant with a slight N-terminal extension of helix 3 and a C-terminal destabilization of helix 2.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	07.10.2008
Dateien geändert am:	07.03.2008
Promotionsantrag am:	03.12.2007
Datum der Promotion:	19.12.2007