Dokument: Der HCN4 Kanal – Genetische Variation und posttranslationale Modifikation

Titel:	Der HCN4 Kanal – Genetische Variation und posttranslationale Modifikation
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70827
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20260203-105233-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wohlfarth, Franziska [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.01.2026 / geändert 18.01.2026
Beitragende:	Prof. Dr. med. Klöcker, Nikolaj [Gutachter] PD Dr. rer. nat. Floss, Doreen [Gutachter] Prof. Dr. rer. nat. Gründer, Stefan [Gutachter]
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Gruppe der Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) Kanäle gehört zur Familie der spannungsabhängigen Kationenkanäle. In erregbaren Zellen des Herzens und des Nervensystems generieren HCN Tetramere den durch Hyperpolarisation aktivierten Schrittmacherstrom If/Ih. Im Herzen von Säugetieren wird hauptsächlich die Isoform HCN4 exprimiert. Dort leistet If einen wichtigen Beitrag zur spontanen Depolarisation kardialer Sinusknotenzellen während der Diastole und reguliert die Herzfrequenz. Als Teil eines makromolekularen Kanalkomplexes modulieren Interaktionspartner auf unterschiedliche Weise If in vivo und tragen zur Funktionsweise von HCN Kanälen bei. Darüber hinaus passen Signalwege mithilfe von Enzymen wie Proteinkinasen die Kanalaktivität an veränderte Bedingungen der Zelle an und können sowohl das gating als auch die Expression regulieren. In den letzten Jahren wurden Mutationen des HCN4 Gens zunehmend in Verbindung mit einer Sinusknotendysfunktion gebracht. Sowohl loss-of-function aber auch gain-of-function Mutationen beeinträchtigten in heterologen Expressionssystemen If und konnten mit kardialen Arrhythmien assoziiert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurde in einer molekulargenetischen Analyse des HCN4 Gens die monoallelische Missense-Mutation V759I bei einer Patientin mit symptomatischer Sinusknotendysfunktion und auffälliger Familienanamnese identifiziert. V759I war zuvor in Fällen von maligner Epilepsie beschrieben worden und galt somit als potenziell pathogen. In heterologen Expressionsanalysen in CHO-Zellen zeigte sich eine signifikant reduzierte Oberflächenexpression der Variante ohne signifikanten Einfluss auf die Gesamtexpression. Diese Beobachtung ließ sich in an diese Arbeit anschließenden Analysen an nativen Zellen nicht reproduzieren, sodass möglicherweise CHO-Zellspezifische Mechanismen den subzellulären Transport der Variante beeinträchtigen. Funktionelle Untersuchungen der genetischen Variation von Erlenhardt et al. (2020) in Xenopus lævis Oozyten zeigten keine Änderung des gating, weder in Spannungsabhängigkeit, cAMP-abhängiger Modulation noch in der Interaktion mit dem neuronalen Bindungspartner PEX5R/Trip8b. Damit übereinstimmend konnte in dieser Arbeit eine Zunahme der Oberflächenexpression des HCN4 Wild-Typs und der Variante durch PEX5R/Trip8b in CHO-Zellen beobachtet werden. In der Zusammenschau der Ergebnisse dieser Arbeit sowie von Erlenhardt et al. erscheint die Missense-Mutation V759I nicht hinreichend, um die Funktion des HCN4 Kanals zu beeinträchtigen und so den Phänotyp der Indexpatientin zu erklären. Eine Phosphoproteom-Analyse an HL-1 Kardiomyozyten der Ratte hatte vier Serin-Reste im N-Terminus des HCN4 Proteins identifiziert, die in Abhängigkeit der Proteinkinase AKT phosphoryliert werden. Im Rahmen eines zweiten Projekts wurde der Einfluss einer Phosphorylierung dieser Aminosäurereste auf die elektrophysiologischen Eigenschaften des HCN4 Stroms in Xenopus lævis Oozyten untersucht. Es konnte keine Änderung der spannungsabhängigen Kanalaktivierung und ihrer Kinetik zwischen phosphomimetischen und phosphoablativen HCN4 Konstrukten detektiert werden. Eine kurzfristige Behandlung mit dem Wachstumsfaktor Insulin-like-growth-faktor-1 (IGF-1), einem bekannten Aktivator der Proteinkinase AKT, führte jedoch auf einer Zeitskala von Minuten zu mindestens einer Verdoppelung der HCN4 Stromexpression. Ein vergleichbarer Effekt blieb bei den genannten phosphomimetischen und phosphoablativen Kanalkonstrukten aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf eine akute Regulation der Stromamplitude des HCN4 Kanals durch den IGF-1/AKT-Signalweg hin. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are members of the voltage-gated cation channel family. In excitable cells of the heart and the central nervous system, tetrameric HCN channels conduct the hyperpolarization-activated pacemaker current If/Ih. HCN4 is the main subtype in the mammalian heart. In cardiac sinoatrial cells, the voltage-dependent channel activation contributes to the spontaneous diastolic depolarization and regulates the heart rate. As part of a macromolecular channel complex, interaction partners modulate features of If in vivo and contribute to HCN channel function. Signaling pathways adapt via protein kinases the activity of If to different cellular conditions and regulate gating and expression. Lately several screening analyses revealed mutations of the HCN4 gene linked to sinus node dysfunction. Both loss-of-function and gain-of-function mutations modulate If in heterologous expression systems and are associated with alterations of cardiac rhythm. In the present work, a genetic analysis of the HCN4 gene of a female patient diagnosed with symptomatic sinus node dysfunction and a positive family history identified the monoallelic missense mutation V759I. Since HCN4 V759I had been described in cases of malignant epilepsy the mutant was classified as likely pathogenic. In Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, the genetic variant showed a reduced cell surface expression without significantly affecting total protein expression. However, surface expression levels in native cells were unaffected comparing wild-type and mutant channel indicating a CHO cell-specific impairment of channel trafficking. In addition, electrophysiological characterization of the variant by Erlenhardt et al. (2020) did not reveal any disturbances of channel gating, neither in voltage-dependence, cAMP-modulation nor interaction with the auxiliary subunit PEX5R/Trip8b. These findings were in line with the concomitant increase in surface expression levels of wild-type and variant cotransfected with PEX5R/Trip8b observed in this work. In summary, the results of this dissertation and from Erlenhardt et al.demonstrate that the missense mutation V759I seems neither sufficient to impair HCN4 channel function nor to explain the phenotype of the index patient. A phosphoproteom analysis of HL-1 rat cardiomyocytes identified four N-terminal serine residues in HCN4, which are phosphorylated in a protein kinase AKT-dependent manner. The second part of this study examined the impact of phosphorylation of these four residues on the electrophysiological properties of HCN4 current in Xenopus lævis oocytes. No effects on voltage-gated channel activation and activation kinetics could be detected between phosphomimetic and constitutively dephosphorylated HCN4 constructs. However, short-term treatment with the known AKT activator insulin-like-growth-factor-1 (IGF-1) at least doubled HCN4 current amplitudes within minutes. IGF-1 exerted no comparable effect on current amplitudes in the respective phosphomimetic or phosphoablative HCN4 mutants. These results indicate an acute modulation of HCN4 current amplitude by activation of the IGF-1/AKT signaling pathway.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie
Dokument erstellt am:	03.02.2026
Dateien geändert am:	03.02.2026
Promotionsantrag am:	05.03.2024
Datum der Promotion:	10.12.2024