Dokument: Biophysikalische und Biochemische Charakterisierung von therapeutisch relevanten Membransystemen
| Titel: | Biophysikalische und Biochemische Charakterisierung von therapeutisch relevanten Membransystemen | |||||||
| Weiterer Titel: | Biophysical and Biochemical Characterization of Therapeutical Relevant Membrane Systems | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70637 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20250910-110339-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Denson, Lora [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Dr. Etzkorn, Manuel [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Kedrov, Alexej [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Membranproteine (MP) sind eine der wichtigsten Komponenten der Zelle in lebenden Organismen. Daher sind gut charakterisierte Präparate von gereinigten Membransystemen wichtig für ein besseres Verständnis der MP, da sie detaillierte Studien ihrer Struktur und Funktion ermöglichen. Eine der größten Klassen von MPs sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), zu denen Mitglieder des Melanocortin Systems gehören - ein Netzwerk aus fünf Rezeptoren, Liganden und zwei akzessorischen Proteinen (MRAP1, MRAP2). Eine Funktionsstörung der Rezeptoren oder der akzessorischen Proteine kann zu verschiedenen Stoffwechselkrankheiten führen. Über seine physiologische und pharmakologische Bedeutung hinaus ist das Melanocortin System ein ideales Modell für die Untersuchung von Membranproteinen und deren Wechselwirkungen.
Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der rekombinanten Expression von MRAP in E. coli und der Optimierung der Proteinreinigung. MRAP-Plasmide wurden in den E. coli-Expressionsstamm transformiert, durch Affinitätschromatographie gereinigt und mittels Massenspektrometrie (MS) analysiert. Die Metallbindung wurde ferner durch Klonierung von MRAP-Mutanten mit Veränderungen an der vorhergesagten Metallbindungsstelle untersucht. Außerdem wurden die MRAPs mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystems (BVE) aus Sf9-Zellen exprimiert und gereinigt. Der zweite Teil des Projekts umfasst die rekombinante Proteinproduktion des menschlichen Noradrenalin-Transporters (hNET) in Sf9-Zellen in Zusammenarbeit mit Dr. Aldino Viegas. hNET spielt eine Schlüsselrolle beim Noradrenalin-Recycling, und seine Dysregulation wird mit kardiovaskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht. In einem letzten Teil wird die Membranbindung untersucht. Nanodiscs, die als Membranmimetika dienen, wurden durch Größenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt und anschließend zur Untersuchung ihrer Wechselwirkungen mit DNazymen durch mikrofluidische Diffusionsmessung (MDS) verwendet. Darüber hinaus wird die potenzielle Hemmung der Membranbindung von Glutathionperoxidase 4 (GPX4) durch einen Inhibitor (IC1) mit Hilfe der Biolayer-Interferometrie (BLI) untersucht. In dieser Arbeit wird die rekombinante Expression von MRAP2 in zwei Systemen und eine Charakterisierung der Metallbindungseigenschaften mit verschiedenen biophysikalischen Methoden vorgestellt. Während diese Studie die Metallbindungseigenschaften in der MRAP-Mutantenprobe bestätigt, deuten die speziellen Mutagenese- und Massenspektrometriedaten darauf hin, dass die Metallbindungseigenschaften durch Verunreinigungen in der Probe verursacht werden. Insgesamt bieten diese Ergebnisse wertvolle Einblicke in Komponenten des Melanocortin Systems und therapeutisch relevante Membransysteme und leisten einen Beitrag zur Erforschung von Membranproteinen.Membrane proteins (MPs) are one of the most vital components of the cell in living organisms. Thus, well-characterized preparations of purified membrane systems are important for a deeper understanding of MPs, as it allows for detailed studies of their structure and function. One of the largest class of MPs are G-protein-coupled receptors (GPCRs), which include members of the melanocortin system - a network of five receptors, ligands, and two accessory proteins (MRAP1, MRAP2). A dysfunction of the receptors or the accessory proteins can lead to various metabolic diseases. Beyond its physiological and pharmacological significance, the melanocortin system serves as an ideal model for studying membrane proteins and their interactions. The first part of this thesis focuses on the recombinant expression of MRAP in E. coli and the optimization of the protein purification. MRAP plasmids were transformed into the E. coli expression strain, purified via affinity chromatography, and analyzed by mass spectrometry (MS). Metal-binding was further assessed by cloning MRAP mutants with alterations in the predicted metal-binding site. Additionally, the MRAPs were expressed and purified from Sf9 cells using the Baculovirus Expression System (BVE). The second part of the project involves the recombinant protein production of the human norepinephrine transporter (hNET) in Sf9 cells, in collaboration with Dr. Aldino Viegas. hNET plays a key role in norepinephrine recycling, and its dysregulation is associated with cardiovascular diseases. As a final part, membrane binding is investigated. Nanodiscs, serving as membrane mimetics, were purified via size exclusion chromatography (SEC) and subsequently used to study their interactions with DNAzymes through Microfluidic Diffusional Sizing (MDS). Additionally, the potential inhibition of glutathione peroxidase 4 (GPX4) membrane binding by an inhibitory compound (IC1) is studied using Biolayer Interferometry (BLI). This work presents the recombinant expression of MRAP2 in two systems and a characterization of the metal-binding properties using different biophysical methods. While this study confirms metal-binding characteristics in the MRAP mutant sample, the dedicated mutagenesis and mass spectrometry data, suggests that the metal-binding characteristics are caused by impurities in the sample. Overall, these findings offer valuable insights into components of the melanocortin system and therapeutical relevant membrane systems, contributing to the field of membrane protein research. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.09.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.09.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 22.04.2025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.07.2025 |
