Dokument: Strukturelle Analyse von Kupferchaperonen und Komplexen des Ethylenrezeptors ETR1 mit Kupferchaperon-ähnlichen Proteinen aus Arabidopsis thaliana
| Titel: | Strukturelle Analyse von Kupferchaperonen und Komplexen des Ethylenrezeptors ETR1 mit Kupferchaperon-ähnlichen Proteinen aus Arabidopsis thaliana | |||||||
| Weiterer Titel: | Structural analysis of copper chaperones and complexes of the ethylene receptor ETR1 with copper chaperone-like proteins from Arabidopsis thaliana | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70432 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20250811-080301-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dluhosch, Dominik Heinz [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Georg Groth [Gutachter] Prof. Dr. Lutz Schmitt [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Ethylenrezeptor, ETR1, Kupfer, Kupferchaperone | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 580 Pflanzen (Botanik) | |||||||
| Beschreibungen: | Bei Ethylen handelt es sich um das einfachste Alken, welches in Pflanzen als Hormon fungiert und eine Reihe von Entwicklungsprozessen, wie z.B. das pflanzliche Wachstum oder die Fruchtreife beeinflusst. Wahrgenommen wird dieses gasförmige Molekül durch eine Gruppe von membranständigen Rezeptoren im Endoplasmatischen Retikulum (ER), welche für ihre Funktion einen Cu(I)-Kofaktor in ihrer Transmembrandomäne (TMD) benötigen. Aufgrund der Fähigkeit von freien Kupfer-Ionen innerhalb der Zelle einen Redoxzyklus zu durchlaufen und dabei die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu katalysieren, liegen diese innerhalb der Zelle nicht in freier Form vor, sondern sind an kleine Proteine, sogenannte Kupferchaperone, gebunden und werden von diesen zu ihrem Bestimmungsort transportiert. Wie genau Ethylenrezeptoren diesen Kofaktor erhalten, ist nur wenig untersucht, jedoch sind sowohl die Kupferchaperone ATX1 und CCH sowie die ebenfalls in der Membran des ER lokalisierte P1B-Typ ATPase RAN1 an diesem Prozess beteiligt. Dabei ist RAN1 essentiell für die Biogenese der Rezeptoren. Eine Besonderheit von CCH ist, dass dieses nur in Pflanzen vorkommt und im Gegensatz zu ATX1 eine zusätzliche, C-terminale Domäne aufweist, deren Funktion ungeklärt ist.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Domäne im Volllängen-Protein intrinsisch ungeordnet und weder an der Bindung von Cu(I)-Ionen beteiligt ist, noch dass die Bindung von Kupfer an CCH eine Änderung in der Struktur der C-terminalen Domäne bewirkt. Diese zusätzliche Domäne beeinflusst jedoch das Dimerisierungsverhalten von CCH, sodass der KD-Wert für die Dimerisierung von CCH im Vergleich zur Deletionsmutante CCHΔ, welche diese C-terminale Domäne nicht enthält, um den Faktor 2-3 geringer ist. Dieser stabilisierende Effekt konnte auch durch eine signifikant erhöhte Schmelztemperatur von CCH gegenüber CCHΔ nachgewiesen werden und ist, basierend auf MD-Simulationen, wahrscheinlich auf zusätzliche Interaktionen von Aminosäureseitenketten des C-Terminus mit der N-terminalen, Cu(I)-bindenden Domäne zurückzuführen. Der C-Terminus selbst ist dabei aber nicht an der Bindung der Cu(I)-Ionen beteiligt. Diese Beobachtungen sind in Einklang mit der Vermutung eines interzellulären Kupfertransports durch CCH, da durch diese Eigenschaften ein sicherer Langstreckentransport von Kupfer ermöglicht wird. Ferner konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass im N-Terminus von RAN1 neben den zwei bekannten MBDs eine weitere Domäne lokalisiert ist, welche eine ATX1-ähnliche Faltung, jedoch nicht das Cu(I)-bindende Motiv aufweist. Die Tertiärstruktur dieser Domäne konnte in dieser Arbeit mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt bzw. bestätigt werden. Durch Interaktionsstudien basierend auf Microscale Thermophoresis (MST) konnte gezeigt werden, dass die Affinität der RAN1-MBDs für ATX1 10-20x höher ist, als für CCH. Ebenso konnte gezeigt werden, dass alle drei MBDs von RAN1 mit ähnlicher Affinität an ETR1 binden. Für alle Interaktionen wurde mittels bioinformatischer Methoden und mit Ausnahme von MBD3, eine Orientierung der Kupferchaperone und MBDs vorhergesagt, welche einen Transfer des Metallions von den Kupferchaperonen auf die MBDs, als auch von den MBDs auf die TMD von ETR1 theoretisch zulassen. Nach dem in dieser Arbeit vorgeschlagenen Mechanismus dient MBD3 der Stabilisierung des ETR1-RAN1-Komplexes, MBD1 nimmt Kupfer von ATX1 auf und überträgt dieses auf MBD2 und MBD2 überträgt anschließend Kupfer auf die TMD von ETR1. Das hier vorgeschlagene Modell dient als Grundlage für künftige Experimente, mittels welchen sich weitere Einblicke in den Kupfertransfer zu den ETRs gewinnen lassen und (potentiell) relevante Aminosäuren für den Transfer von Kupfer in die ETR1 TMD identifiziert werden können.Ethylene represents the simplest alkene and functions as a plant hormone, which influences a variety of developmental processes such as plant growth or fruit ripening. This gaseous molecule is perceived by a group of integral membrane-proteins (receptors) at the endoplasmic reticulum (ER), which require a Cu(I)-cofactor for their function. This cofactor is located in the receptors transmembrane domain (TMD). Due to the ability of copper ions to undergo a redox cycle within cells and thereby catalyze the formation of reactive oxygen species (ROS), these Cu(I)-ions are not present in free form within the cell but are bound to small proteins, so-called copper chaperones. Among other small copper binding ligands, these copper chaperones safely transport their cargo to their molecular target. Little is known on how exactly ethylene receptors obtain this copper cofactor, but both the copper chaperones ATX1 and CCH as well as the P1B-type ATPase RAN1, which is also localized in the membrane of the ER, are involved in this process and RAN1 has been shown to be essential for the biogenesis of the receptors. In contrast to ATX1, CCH is only present in plants and contains an additional C-terminal domain whose function is yet unknown. In this work, it was demonstrated that this domain is intrinsically disordered in the full-length protein and that this domain is neither involved in the binding of Cu(I)-ions, nor that the binding of copper to CCH causes a change to the structure of the C-terminal domain. However, this additional domain influences the dimerization behavior of CCH, so that the KD-value for the dimerization of CCH is lower by a factor of 2-3 compared to the deletion mutant CCHΔ, which does not contain this C-terminal domain. This stabilizing effect is also evident by the significantly increased melting temperature of CCH compared to the deletion mutant CCHΔ, lacking this domain. Based on molecular dynamics (MD)-simulations, this is probably due to additional interactions of the C-terminus with the N-terminal, Cu(I)-binding domain. The C-terminus itself however, is not involved in the binding of Cu(I)-ions. These observations are consistent with the assumption of an intercellular copper transport mediated by CCH, as these properties support a safe long-distance transport of copper. Furthermore, it was shown in this work that in addition to the two known MBDs, another domain featuring the ATX1-like fold but not the Cu(I)-binding motif, is localized in the N-terminus of RAN1. The tertiary structure of this domain was determined/confirmed by X-ray crystallography. Interaction studies based on microscale thermophoresis (MST) demonstrated that the affinity of the RAN1-MBDs for ATX1 is 10-20 times higher than for CCH. In this work, it was further shown that all three MBDs of RAN1 bind to ETR1 with similar affinities. For all interactions, an orientation of the copper chaperones and MBDs was predicted by bioinformatic methods, so that a transfer of copper from the copper chaperones to the MBDs as well as from the MBDs to the TMD of ETR1 seems theoretically possible. According to the mechanism/model proposed in this work, MBD3 serves to stabilize the ETR1-RAN1 complex, MBD1 receives copper from ATX1 and transfers it to MBD2, and MBD2 subsequently transfers copper to the TMD of ETR1. The model proposed here serves as a basis for future experiments to gain additional insights into the copper transfer to the ETRs and to identify amino acids that are relevant for the transfer of copper into the ETR1 TMD. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Biochemie der Pflanzen | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.08.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.08.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 13.03.2025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 25.06.2025 |
