Dokument: Metabolic engineering of Pseudomonas taiwanensis for the improved production of styrene

Titel:	Metabolic engineering of Pseudomonas taiwanensis for the improved production of styrene
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70422
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250811-111401-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Rönitz, Jakob [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,72 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.08.2025 / geändert 01.08.2025
Beitragende:	Prof. Dr. Wierckx, Nick [Gutachter] Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Styrol (auch Styrene) ist ein wichtiger Bestandteil von Polymeren und findet sich in zahlreichen Alltagsprodukten wie Elektronik, Spielzeug, Verpackungsmaterial und Autoreifen. Die Herstellung von Styrol basiert zurzeit jedoch ausschließlich auf petrochemischen Verfahren, was aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit fossiler Rohstoffe keine langfristige Lösung darstellt. Eine nachhaltige Lösung bietet die biotechnologische Herstellung von Styrol. Allerdings ist die Entwicklung entsprechender Bioprozesse herausfordernd, da Styrol sowohl toxisch als auch flüchtig ist. Daher ist die Anwendung eines lösungsmitteltoleranten Organismus, wie Pseudomonas taiwanensis VLB120, vorteilhaft. Zudem ist die Kultivierung mit flüchtigen Lösungsmitteln mit hohem Arbeitsaufwand verbunden, was den Durchsatz von Experimenten begrenzt. Dieses Problem wurde mit der Entwicklung des SIGHT Systems (englisch für „solvent-tight incubation and growth monitoring in high throughput”) behoben, das mit dem Growth Profiler (EnzyScreen) kompatibel ist und die Wachstumsüberwachung von bis zu 240 Kulturen gleichzeitig ermöglicht. Die hohe Kapazität des SIGHT Systems wurde für die adaptive Laborevolution (ALE) von P. taiwanensis GRC3 angewendet, was die Isolierung von Klonen mit verbessertem Wachstum in Gegenwart einer zweiten Phase Styrol ermöglichte. Des Weiteren wurde ein lösungsmittelinduzierbarer Biosensor eingesetzt, um die Styrol-Konzentration im Cytoplasma eines lösungsmittelsensitiven sowie eines lösungsmitteltoleranten P. taiwanensis Stammes unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen zu bestimmen, was die Berechnung der Styrol-Akkumulation in der Zellmembran ermöglichte. In Gegenwart einer zweiten Phase Styrol betrug die Konzentration im Cytoplasma eines lösungsmitteltoleranten Stammes auf der Basis von P. taiwanensis GRC2 lediglich 0,45 mM. Im Vergleich zum Medium ist die Styrol Konzentration in der Zelle um das 6,2-fache niedriger, was auf die Aktivität der Lösungsmittel-Pumpe TtgGHI in diesem Stamm zurückzuführen ist. Somit wurden neue Einblicke in die Physiologie lösungsmitteltoleranter Pseudomonaden ermöglicht. Die Aktivität der TtgGHI Lösungsmittel-Pumpe ist jedoch sehr energieintensiv und stellt eine zusätzliche Belastung für den Stoffwechsel von Styrol-produzierenden Stämmen dar, welche eine erhöhte Menge an L-Phenylalanin – der Vorstufe für die Styrol Biosynthese –produzieren müssen. Der Styrol-Biosynthese-Weg, bestehend aus einer Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) aus Arabidopsis thaliana und einer Ferulasäure-Decarboxylase (FDC) aus Saccharomyces cerevisiae, wurde in das Genom des L-Phenylalanin überproduzierenden Stammes P. taiwanensis GRC3 Δ8ΔpykA-tap integriert. Dieser wurde darüber hinaus zusätzlich genetisch verändert, um eine Balance zwischen Vorstufen-Biosynthese und der Widerstandsfähigkeit des Stammes herzustellen. Diese Optimierung erhöhte die de novo-Produktion von Styrol aus Glukose auf 1,30 mM gelöst im Medium (2,68 mM insgesamt, unter Berücksichtigung der Gasphase), was eine Verbesserung um 8,1% darstellt. Zudem wurden P. taiwanensis-Stämme ohne Modifikationen in der L-Phenylalanin-Biosynthese für die Biotransformation von Zimtsäure zu Styrol eingesetzt. Mit diesem Ansatz wurde eine Umsetzung von 50 mM Zimtsäure erreicht, was zur Bildung einer zweiten Phase Styrol in der Kultur führte. Insgesamt leistet diese Dissertation einen Beitrag zum physiologischen Verständnis von Lösungsmitteltoleranz in P. taiwanensis, sowie der Balance zwischen Toleranz und Styrol-Biosynthese, was die Eignung dieses Organismus für die Entwicklung von nachhaltiger Styrol-Produktion hervorhebt. Styrene is an important building block for polymers and that is found in a broad spectrum of products that are omnipresent in our modern society, including consumer electronics, toys, packaging material, and car tires. However, the production of styrene is currently solely based on the petrochemical industry, which does not represent a viable long-term strategy due to the limited abundance of fossil resources. Biotechnological production of this compound provides a sustainable alternative to the supply issue, but the high toxicity and volatility of styrene poses challenges for the development of a bioprocesses. Due to high product toxicity, the use of a solvent-tolerant host organism such as Pseudomonas taiwanensis VLB120 is favourable for this application. However, cultivation of bacteria in presence of volatile solvents also poses special requirements to the cultivation system, resulting in limited throughput and high manual workload for experiments. In this thesis, this challenge was addressed by the development of the SIGHT (solvent-tight incubation and growth monitoring in high throughput) system, which prevents evaporation of volatile compounds and allows to utilise the Growth Profiler (EnzyScreen) platform, enabling incubation and non-invasive online growth monitoring of up to 240 cultures in parallel. The high-throughput capacity of the SIGHT system was demonstrated by adaptive laboratory evolution (ALE) of P. taiwanensis GRC3 to further increase styrene tolerance, which allowed isolation of clones with improved growth in presence of a second phase of styrene. Furthermore, a solvent-inducible biosensor was applied to determine styrene concentrations in the cytosol of a solvent-sensitive and solvent-tolerant P. taiwanensis strain at different levels of exposure, which enabled calculation of styrene accumulation in the inner membrane. When exposed to a second phase of styrene, the concentration in the cytosol of solvent-tolerant P. taiwanensis GRC2 was only 0.45 mM, which is 6.2-fold lower compared to the medium, due to activity of the TtgGHI solvent efflux pump harboured by this strain. This allowed to gain new insights into the physiology of solvent-tolerant Pseudomonads under stress conditions and further highlighted their suitability as hosts for styrene bioproduction. However, maintaining activity of the TtgGHI solvent efflux pump is highly energy demanding and puts an additional burden on the metabolism of styrene production strains, which also need to overproduce L-phenylalanine, the precursor required for styrene biosynthesis. The styrene biosynthesis pathway consisting of a phenylalanine ammonia-lyase (PAL) from Arabidopsis thaliana and ferulic acid decarboxylase (FDC) from Saccharomyces cerevisiae was integrated into the genome of L-phenylalanine-overproducing strain P. taiwanensis GRC3 Δ8ΔpykA-tap and genetic engineering was applied to balance precursor biosynthesis and strain fitness. This optimisation increased de novo production of styrene from glucose to a concentration of 1.30 mM in the aqueous phase (2.68 mM in total, including gas phase), representing an improvement of 8.1% compared to the starting strain. Furthermore, highly styrene-tolerant P. taiwanensis strains without modified L-phenylalanine biosynthesis were applied for biotransformation of t-cinnamate to styrene as an alternative to de novo biosynthesis. This approach allowed complete conversion of up to 50 mM t-cinnamate, which corresponds to saturation of the medium and formation of a second phase of styrene in the culture. Overall, this thesis contributed to physiological understanding of solvent tolerance in P. taiwanensis as well as the balance between tolerance and styrene biosynthesis, which facilitates the suitability of this host organism for further development of a sustainable styrene production process.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	11.08.2025
Dateien geändert am:	11.08.2025
Promotionsantrag am:	29.04.2025
Datum der Promotion:	10.06.2025