Dokument: Unraveling host-derived molecular mechanisms for interacting with a bacterial endosymbiont in the trypanosomatid Angomonas deanei with a particular focus on endosymbiont division
| Titel: | Unraveling host-derived molecular mechanisms for interacting with a bacterial endosymbiont in the trypanosomatid Angomonas deanei with a particular focus on endosymbiont division | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70203 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20250718-170558-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Maurya, Anay Kumar [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Nowack, Eva C. M. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Hegemann, Johannes H. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Endosymbiosis has been a key process in the evolution of eukaryotic cells, as mitochondria and plastids, the organelles responsible for energy supply in most eukaryotic cells, were acquired via endosymbiotic events. Both events occurred more than 1.5 billion years ago, which makes it difficult to study the early steps of endosymbiosis and organelle evolution.
During my doctoral research, I used a recent endosymbiotic system, the trypanosomatid Angomonas deanei with a single bacterial endosymbiont (ES). To understand the level of integration of the ES in A. deanei, the lab had previously characterized the proteome of isolated endosymbionts by protein mass spectrometry and found seven host-encoded proteins targeted to the ES, which were termed ‘endosymbiont-targeted proteins’ (ETPs). It was postulated that these proteins provide the host with control over its ES. Overexpression of fluorescent protein fusions of ETPs showed differential subcellular localization of various ETPs. Recombinant ETP9, ETP2, and ETP7 formed a ring-like structure around the ES division site (ESDS). ETP5 was detected at the periphery of the ES. Additionally, it showed a fluorescence signal at the upper flagellar pocket of the host cell as well as associated with the nucleus, kinetoplast, and possibly cytoskeletal structures. ETP1 showed a fluorescence signal at the ES envelope. Lastly, ETP3 and ETP8 appeared to localize in the ES cytosol and the Golgi apparatus, based on confocal microscopy data. This observation led to the hypothesis that their import is mediated by vesicular transport. Vesicle fusions with specific target membranes are usually mediated by specific SNARE proteins, and interestingly, three nucleus-encoded SNARE proteins were identified in the ES fractions. The overarching goal of this thesis was to elucidate molecular mechanisms underlying the host-symbiont interaction and the role of ETPs in A. deanei. To this end, I specifically aimed at (I) studying the localization of ETP9, ETP2, and ETP7 throughout cell cycle stages, (II) investigating cellular functions of ETP9, ETP2, ETP7, ETP1, and ETP5, and (III) exploring the question if SNARE proteins may mediate vesicle fusion to the ES and likely the import of ETP3 and ETP8. To study the localization of ETP9, ETP2, and ETP7 over the cell cycle stages, I performed IFA and found that all three ETPs showed a cell cycle-dependent localization where ETP7 appeared to be always detectable over the ES, however, it enriched at the ESDS during bacterial elongation. This is followed by the arrival at the ESDS of ETP2, the ES-encoded FtsZ, and finally ETP9. To investigate the cellular functions of ETP9 and ETP2, I performed a complementation analysis and found that ETP9 and ETP2 fused to the green fluorescent protein eGFP expressed from their respective endogenous loci, showed the same fluorescence pattern as the overexpressed versions. However, the function of the recombinant ETP9, but not ETP2, appeared to be partially impaired as cells showed division phenotypes, for example, with the ES forming long tubular chains. This problem was largely solved by using the smaller V5 tag instead of eGFP. Further, we found by comparative genomics that the ES has lost most of the essential division components and the autonomy to divide. ETP9, ETP2, and ETP7 compensate for the loss of bacterial division proteins. The generation of heterozygous deletion mutants revealed that etp9 mutants showed weak division phenotypes, but not etp2 mutants. Importantly, homozygous mutants could not be generated for etp9 but was possible for etp2 which interestingly showed severe division phenotypes such as long filamentous endosymbionts. Since the generation of homozygous mutants of etp9 was not possible, I developed a protocol for specific gene knockdowns using morpholino antisense oligos (MAOs) and used it to knockdown protein synthesis from etp9 as well as etp2 and etp7 mRNA. This resulted in similar division phenotypes as described above suggesting their roles in ES division. To find the cellular function of ETP1, a heterozygous etp1 mutant was previously generated. Further, I observed by microscopy that endosymbionts in this mutant appeared roundish compared to the regular peanut-shape of the ES in Wt cells, suggesting a role in structural maintenance of the ES. To explore the cellular function(s) of ETP5, I performed knockout studies and found that reduced gene dosage of etp5 resulted in a slower growth rate with division phenotypes, for instance, the elongated ES. Based on all observations, it appears that ETP5 mainly plays a role in segregation of the ES and other cellular structures to the daughter cells and contributes to ES division. To explore the question if ETP3 and ETP8 could be imported into the ES via vesicle fusion mediated by SNARE proteins, I studied the subcellular localization of SNARE proteins. I observed that two of the SNAREs showed a fluorescence signal mainly at the flagellar pocket. Additionally, a weak dot-like fluorescence signal in close vicinity of the ES was detected in many cells. To test if these signals close to the ES result from ETP-carrying vesicles that eventually fuse with the ES outer membrane (OM), further analyses by transmission electron microscopy (TEM) of SNARE-containing vesicles and their possible co-localization with ETP3 and ETP8 by double labelling is planned. In conclusion, the studies of this thesis show that the ES co-evolved with its host and both partners show coordinated cell cycle stages, protein import from the host, and importantly the evolution of a host-derived ES division and segregation machineries controlling the ES has occurred. The data suggests that the bacterium has evolved far beyond an ES and already fulfils some of the criteria of being an early-stage organelle that provides essential metabolites to its host. This work lays the basis for further studies to understand key events involved in the organelle evolution.Die Endosymbiose war ein Schlüsselprozess in der Evolution eukaryontischer Zellen, da Mitochondrien und Plastiden, die Organellen, die in den meisten eukaryontischen Zellen für die Bereitstellung von Energie verantwortlich sind, durch endosymbiontische Ereignisse erworben wurden. Beide Ereignisse fanden vor mehr als 1,5 Milliarden Jahren statt, was es schwierig macht, die frühen Schritte der Endosymbiose und der Organellenentwicklung zu untersuchen. Während meiner Doktorarbeit habe ich ein verhältnismäßig junges Endosymbiosesystem verwendet, den Trypanosomatiden Angomonas deanei mit einem einzelnen bakteriellen Endosymbiont (ES). Um den Grad der Integration des ES in A. deanei zu verstehen, hatte das Labor zuvor das Proteom isolierter Endosymbionten mit Hilfe der Protein-Massenspektrometrie charakterisiert und sieben vom Wirt kodierte Proteine gefunden, die am ES lokalisieren und als „endosymbiont-targeted proteins“ (ETPs) bezeichnet werden. Es wurde postuliert, dass diese Proteine dem Wirt Kontrolle über seinen ES ermöglichen. Die Überexpression von Fluoreszenzproteinfusionen der ETPs zeigte eine unterschiedliche subzelluläre Lokalisierung der verschiedenen ETPs am ES. Die rekombinanten Proteine ETP9, ETP2 und ETP7 bildeten eine ringförmige Struktur um die ES-Teilungsstelle (ESDS). ETP5 wurde an der Peripherie des ES nachgewiesen. Außerdem zeigte es ein Fluoreszenzsignal in der Flagellentasche der Wirtszelle sowie eine Verbindung mit dem Zellkern, dem Kinetoplasten und möglicherweise mit Zytoskelettstrukturen. ETP1 zeigte ein Fluoreszenzsignal an der ES-Hülle. ETP3 und ETP8 schließlich scheinen im Cytosol des ES und im Golgi-Apparat zu lokalisieren, wie konfokale Mikroskopiedaten zeigen. Ihr Import wird möglicherweise durch vesikulären Transport bewerkstelligt. Vesikelfusionen mit spezifischen Zielmembranen werden üblicherweise durch spezifische SNARE-Proteine vermittelt, und interessanterweise wurden in den ES-Fraktionen per Massenspektrometrie drei im Nucleus kodierte SNARE Proteine identifiziert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die der Wirt-Symbionten-Interaktion und der Rolle der ETPs in A. deanei zugrunde liegen. Zu diesem Zweck wollte ich insbesondere (I) die Lokalisierung von ETP9, ETP2 und ETP7 während der verschiedenen Stadien des Zellzyklus untersuchen, (II) die zellulären Funktionen von ETP9, ETP2, ETP7, ETP1, und ETP5 analysieren und (III) erste Hinweise darauf finden, ob SNARE-Proteine möglicherweise die Vesikelfusion mit dem ES und wahrscheinlich den Import von ETP3 und ETP8 vermitteln. Um die Lokalisierung von ETP9, ETP2 und ETP7 während der Stadien des Zellzyklus zu untersuchen, führte ich IFA durch und stellte fest, dass alle drei ETPs eine zellzyklusabhängige Lokalisierung aufwiesen, wobei ETP7 immer am gesamten ES nachweisbar zu sein schien, sich jedoch während der bakteriellen Elongation an der ESDS anreicherte. Im Anschluss an diesen Prozess folgt die schrittweise Anreicherung von ETP2, dem vom Bakterium kodierten FtsZ und schließlich ETP9 an der ESDS. Um die zellulären Funktionen von ETP9 und ETP2 zu untersuchen, führte ich zunächst eine Komplementationsanalyse durch und stellte fest, dass ETP9 und ETP2 fusioniert mit eGFP, die von ihren endogenen Loci exprimiert wurden, das gleiche Fluoreszenzmuster zeigten wie die überexprimierten Versionen. Allerdings schien die Funktion von ETP9, nicht aber von ETP2, teilweise beeinträchtigt zu sein, da die Zellen Teilungsphänotypen zeigten, bei denen die ES beispielsweise lange röhrenförmige Ketten bildeten. Dieses Problem konnte durch die Verwendung eines kleineren V5-Tags anstelle von eGFP weitgehend gelöst werden. Durch vergleichende Genomik haben wir festgestellt, dass der ES die meisten wesentlichen Teilungskomponenten und die Autonomie zur Teilung verloren hat. Interessanterweise stellten wir fest, dass ETP9, ETP2 und ETP7 den Verlust der bakteriellen Teilungsproteine kompensieren. Die Erzeugung heterozygoter Deletionsmutanten zeigte, dass etp9-Mutanten einen schwachen Teilungsphänotyp aufwiesen, nicht aber etp2-Mutanten. Wichtig ist, dass homozygote Mutanten für etp9 nicht erzeugt werden konnten, wohl aber für etp2, die interessanterweise schwere Teilungsphänotypen wie lange filamentöse Endosymbionten zeigten. Da die Erzeugung homozygoter Mutanten von etp9 nicht möglich war, verwendete ich Morpholino-Antisense-Oligos (MAOs), um die Proteinsynthese ausgehend von etp9- sowie von etp2- und etp7-mRNA spezifisch auszuschalten. Dies führte zu ähnlichen Teilungsphänotypen wie oben beschrieben, was auf ihre Rolle bei der ES-Teilung schließen lässt. Um die zelluläre Funktion von ETP1 zu ermitteln, wurde zuvor eine heterozygote etp1-Mutante erzeugt. Außerdem beobachtete ich mit Hilfe von Mikroskopie, dass die Endosymbionten im Vergleich zur Erdnussform in Wt-Zellen rundlich erschienen, was auf eine Rolle bei der strukturellen Aufrechterhaltung des ES hindeutet. Um die zelluläre(n) Funktion(en) von ETP5 zu erforschen, habe ich Knockout-Studien durchgeführt und festgestellt, dass eine reduzierte Gendosierung von etp5 zu einer langsameren Wachstumsrate mit Teilungsphänotypen, z. B. verlängerten ES, führt. Aus allen Beobachtungen geht hervor, dass ETP5 hauptsächlich eine Rolle bei der Verteilung der ES und anderer zellulärer Strukturen auf die Tochterzellen spielt und zur Teilung der ES beiträgt. Um zu verstehen, ob ETP3 und ETP8 in den ES importiert werden, wahrscheinlich durch die von SNARE-Proteinen vermittelte Fusion von Wirtsvesikeln mit dem ES, habe ich zunächst die subzelluläre Lokalisierung der SNARE-Proteine untersucht. Ich beobachtete, dass zwei der SNAREs ein Fluoreszenzsignal hauptsächlich in der Flagellentasche zeigten. Zusätzlich wurde in vielen Zellen ein schwaches, punktförmiges Signal in unmittelbarer Nähe zum ES entdeckt. Eine weitere Untersuchung, ob diese SNARE-positiven Vesikel tatsächlich ETPs durch Fusion mit der äußeren ES-Membran in den ES transportieren, soll später durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Ko-Lokalisationsanalysen von ETP3 und ETP8 und den SNAREs durch Doppelmarkierung durchgeführt werden. Zusammenfassend zeigen die Studien dieser Arbeit, dass sich der ES gemeinsam mit seinem Wirt entwickelt hat und dass beide Partner koordinierte Zellzyklusphasen und den Import von Proteinen aus dem Wirt aufweisen, und, was besonders wichtig ist, dass sich eine vom Wirt abgeleitete ES-Teilungs- und -Segregationsmaschinerie entwickelt hat, die den ES kontrolliert. Die Daten deuten darauf hin, dass sich das Bakterium weit über einen ES hinaus entwickelt hat und bereits einige der Kriterien eines Organells im Frühstadium erfüllt, das seinen Wirt mit wichtigen Stoffwechselprodukten versorgt. Diese Arbeit bildet die Grundlage für weitere Studien zum Verständnis der Schlüsselereignisse, die an der Organellevolution beteiligt sind. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.07.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.07.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 16.05.2025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 11.07.2025 |
