Dokument: Entwicklung einer Methode zu Amplifikation und Sequenzierung des kompletten Genoms des Hepatitis C Virus
| Titel: | Entwicklung einer Methode zu Amplifikation und Sequenzierung des kompletten Genoms des Hepatitis C Virus | |||||||
| Weiterer Titel: | Development of a method for amplification and sequencing of the complete genome of the hepatitis C virus | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70107 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20250711-144118-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Neuroth, Camilla Sophia [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Timm, Jörg [Gutachter] PD Dr. rer. nat. Floß, Doreen M. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind weltweit circa 50 Millionen Menschen
chronisch mit dem Hepatitis C Virus infiziert. Diese Erkrankung kann unbehandelt zu schwerwiegenden Leberschäden und zum Tod führen. Eine frühzeitige Diagnose und eine effektive Therapie sorgen für die Unterbrechung von Infektionsketten und sind daher Ziele in der Bekämpfung der Virushepatitis. Seit 2015 können durch direct-acting antivirals Virusheilungsraten von > 95 % erreicht werden. Dennoch stagniert der zuvor beobachtete Rückgang der gemeldeten Infektionen mit dem Hepatitis C Virus. Fragen, wo und durch wen sich Menschen mit dem Virus anstecken, können durch Kontaktnachverfolgung und phylogenetische Analyse besser beantwortet werden, wie diese zum Beispiel (z.B.) bereits in der Ebola-Epidemie 2013-2016 oder der Corona-Pandemie 2020-2022 erfolgreich durchgeführt wurden. Für eine optimal aufgelöste phylogenetische Analyse ist die Aufschlüsselung des gesamten Virusgenoms notwendig. Ziel dieser Dissertationsarbeit ist daher insbesondere die Entwicklung einer Ganzgenom- polymerase chain reaction (PCR). In der Entwicklung einer Ganzgenom-PCR des Hepatitis C Virus stellen unter anderem die hohe Variabilität als auch die acht unterschiedlichen Genotypen eine Herausforderung dar. In dieser Dissertationsarbeit wurde der Ansatz einer Genotyp-spezifischen Tiling-PCR verfolgt, bei der das Genom in vielen kleinen, überlappenden Abschnitten amplifiziert, anschließend sequenziert und bioinformatisch wieder zusammengesetzt wird. Nach der PCR erfolgte eine MinION-Sequenzierung mittels Nanopore sowie eine bioinformatische Datenauswertung. Dabei wurde sich auf die in der Düsseldorfer Kohorte vorherrschenden Genotypen (GT) 1a, 1b, 3a, 4a und 4d konzentriert. Mit einer Ganzgenom-PCR soll eine möglichst hohe Genomabdeckung erzeugt werden. Mit der Tiling-PCR wurde eine Genomabdeckung > 90 % bei 64 % der Proben des GT 1a, bei 77 % der Proben des GT 1b, bei 98 % der Proben des GT 3a, bei 60 % der Proben des GT 4a und bei 77 % der Proben des GT 4d erreicht. Eine Genomabdeckung > 95 % wurde bei 25 % der Proben des GT 1a, bei 47 % der Proben des GT 1b, bei 90 % der Proben des GT 3a, bei 60 % der Proben des GT 4a und bei 62 % der Proben des GT 4d beobachtet. Für alle fünf Genotypen gemeinsam betrachtet wurde im Mittel eine Genomabdeckung von 91 % (± 15 %) erreicht. Limitierende Faktoren der PCR stellen z.B. die Viruslast und die Probenqualität dar. Weiterführende Arbeiten haben als Ziel die Optimierung und Validierung der Tiling-PCR, sodass eine neue Standarddiagnostikmethode im Institut für Virologie der Uniklinik Düsseldorf etabliert werden kann.According to the World Health Organization, around 50 million people worldwide are chronically infected with the hepatitis C virus. If left untreated, this disease can lead to serious liver changes and death. Early diagnosis and effective treatment ensure that chains of infection are interrupted and are therefore goals in the fight against viral hepatitis. Since 2015, direct-acting antivirals have been able to achieve viral cure rates of > 95 %. Nevertheless, the previous drop in new infections with the hepatitis C virus has stagnated since 2015. Questions about where and through whom people become infected with the virus can be answered by contact tracing and phylogenetic analysis, as has already been successfully carried out in the Ebola epidemic 2013-2016 or the Corona pandemic 2020-2022, for example. For a highresolution phylogenetic analysis, it is necessary to break down the entire virus genome. The aim of this dissertation is therefore especially to develop a whole genome polymerase chain reaction (PCR). In the development of a whole genome PCR of the hepatitis C virus, the high variability as well as the eight different genotypes pose a challenge. In this dissertation, the approach of a genotype-specific tiling PCR was pursued, in which the genome is amplified in many small, overlapping sections, then sequenced and bioinformatically reassembled. The PCR was followed by MinION sequencing using a nanopore and bioinformatic data analysis. The focus was on the predominant genotypes (GT) 1a, 1b, 3a, 4a and 4d in the Düsseldorf cohort. The aim of whole genome PCR is to achieve the highest possible genomic coverage. With tiling PCR, genomic coverage > 90 % was achieved in 64 % of the samples of the GT 1a, 77 % of the GT 1b samples, 98 % of the GT 3a samples, 60 % of the GT 4a samples and 77 % of the GT 4d samples. Genomic coverage > 95 % was observed in 25 % of GT 1a samples, in 47 % of GT 1b samples, in 90 % of GT 3a samples, in 60 % of GT 4a samples and in 62 % of GT 4d samples. Considering all five genotypes together, an average genomic coverage of 91 % (± 15 %) was achieved. Limiting factors of the PCR are for example viral load and sample quality. The aim of further work is to optimize and validate the tiling PCR so that a new standard diagnostic method can be established at the Institute of Virology at Düsseldorf University Hospital. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.07.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.07.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.02.2025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 01.07.2025 |
