Dokument: Synthese multivalenter Glykooligomere mithilfe von enzymatischer oder DNA vermittelter Glykokonjugation von Zuckern an sequenzdefinierten Oligo(amidoaminen)

Titel:	Synthese multivalenter Glykooligomere mithilfe von enzymatischer oder DNA vermittelter Glykokonjugation von Zuckern an sequenzdefinierten Oligo(amidoaminen)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=70046
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250703-080722-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hofer, Marc Lennart [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,73 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.06.2025 / geändert 30.06.2025
Beitragende:	Prof. Dr. Laura Hartmann [Gutachter] Prof. Dr. Thomas J. J. Müller [Gutachter]
Stichwörter:	Enzymatische Reaktion, Neu5Ac, Zuckerpolymere, Multivalenz, DNA, Holliday Junction, Calix[n]arene
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Zucker, auch Glykane genannt, sind essenzielle Bausteine aller Organismen. Insbesondere auf Zelloberflächen sind eine Vielzahl verschiedener Glykane präsent. Diese Glykanschicht wird Glykokalyx genannt und besteht aus Glykoproteinen, Glykolipiden oder Proteoglykanen. Diese fungieren als Signalübermittler in zahlreichen biologischen Prozessen, wie Zell-Zell- Kommunikation und Zelladhäsion. Auch Pathogene nutzen die Glykokalyx und die zuckervermittelte Anbindung eines Pathogens an der Zelloberfläche ist häufig der erste Schritt des Infektionsprozesses. Um einerseits die biologischen Prozesse im Körper und andererseits den Infektionsmechanismus der Pathogene zu verstehen, ist es von Interesse, den Aufbau und die Wechselwirkung der Glykane zu untersuchen. Ein Glykanmotiv, das von vielen Pathogenen, insbesondere Viren, in der Zellanbindung genutzt wird, ist die Neuraminsäure (Neu5Ac). Darüber hinaus ist dieser Zucker an vielen weiteren biologischen Prozessen beteiligt. Da die Isolierung Neu5Ac-haltiger Glykane und Glykankonjugate kompliziert ist, ist ein alternativer Ansatz die Erzeugung sogenannter Glykanmimetika, die als Modelle zur Untersuchung der biologischen Funktion der Glykane eingesetzt werden können. Ein weit verbreiteter Ansatz ist die Beschränkung der komplexen natürlichen Glykanliganden auf das minimale Bindungsmotiv. Hierbei werden alle Kohlenhydrateinheiten, die vermutlich nicht direkt an der Bindung beteiligt sind, vernachlässigt. Die verbleibenden Kohlenhydratliganden werden dann an ein künstliches Gerüst angebracht, um über diese multivalente Präsentation eine Bindungsverstärkung zu erreichen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, drei unterschiedliche Methoden zur Funktionalisierung variabler aber gleichzeitig strukturell definierter und multivalenter Gerüste mit Neu5Ac zu etablieren. Hierfür wurden sowohl chemische als auch enzymatische Methoden verwendet. Eine der bereits etablierten enzymatischen Methoden ist das Exo-Enzymatischen-Labelling-System aus NmCSS und PmST1 zur Sialylierung von Galaktoseeinheiten. Kürzlich wurde von Konietzny aus dem Arbeitskreis Hartmann herausgefunden, dass es neben der gezielten Sialylierung von Galaktose funktionalisierten Strukturen auch zur Sialylierung des Tris-Puffers kommt. Diese Entdeckung ermöglicht eine einfache chemoenzymatische Synthese von nicht glykanbasierten Neu5Ac-Derivaten auf Basis von natürlichen und nicht natürlichen Substraten für biologische und medizinische Anwendungen. Aus diesem Grund wurde im ersten Teil dieser Arbeit die chemoenzymatische Synthese von neuartigen Neu5Ac-Derivaten untersucht. Hierbei wurde insbesondere ein Fokus auf die Sialylierungsbedingungen, ein Screening verschiedener Substratklassen (Tris-, Glycerin-, Ethylenglycol-, Polyol-basierte) und die Isolation der sialylierten Substrate gelegt. Es konnte gezeigt werden, dass Substrate mit mindestens zwei Hydroxygruppen in räumlicher Nähe sialyliert werden können. Außerdem konnte gezeigt werden, dass elektronendonierende und elektronenreiche funktionelle Seitenketten eine Sialylierung begünstigen. Die Isolation der sialylierten Derivate konnte mit einer für niedermolekulare Substanzen optimierten GPC erreicht werden. Zusätzlich wurden erste Versuche für die Synthese von Neu5Ac-funktionalisierten Tris-Copolymeren durchgeführt. Im zweiten Teil wurde anstelle einer enzymatischen kovalenten Verknüpfung der Oligo(amidoamin)-¬Gerüste und Sialinsäure die Möglichkeit zu DNA-vermittelten Konjugation untersucht. In einer Kooperation mit Prof. Kjems und seinem Team wurden Oligo(amidoamin)-Gerüste mehrfach mit Oligonukleotid Seitenketten funktionalisiert. Diese sind Teil der sogenannten Holiday Junctions, einem X-förmigen DNA-Origami Motiv. In der vorliegenden Arbeit konnten erfolgreich ein bis drei Holiday Junctions durch Selbstassemblierung an einem Cumarin-gelabelten Oligo(amidoamin)-Gerüst konjugiert und isoliert werden. Zukünftig können dann Sialinsäuren an die Oligonukleotid-Segmente angebracht werden und so eine sequenzdefinierte, multivalente Präsentation ermöglicht werden. Im dritten Teil der Arbeit wurden von Alisa Kayser synthetisierte Calix[n]aren-Gerüste (n=4 und 5) zur Verfügung gestellt und über chemische Konjugation mittels Cu-vermittelter Azid-Alkin-Reaktion mit Sialinsäuren funktionalisiert. Hierfür wurden drei Calix[5]aren-Oligomere mit unterschiedlichen Bindungsabständen und Valenz der Neu5Ac und ein Calix[4]aren-Oligomer synthetisiert. Die so erhaltenen Liganden präsentieren fünf oder zehn Neu5Ac und orientieren sich in ihrer Größe und Anordnung der Glykanfragmente an dem pentameren VP1 Kapsidprotein des Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV). Beim MCPyV handelt es sich um den ersten bekannten Onkovirus der Polyomaviren. Es ist bekannt, dass nur Zellen, die mit Neu5Ac funktionalisiert sind, von dem MCPyV infiziert werden können. Das VP1 Kapsidprotein besteht aus einem symmetrischen, ringförmigen Homopentamer aus fünf VP1 Subeinheiten, die Neu5Ac binden können. Es konnte bereits für flexible lineare Liganden eine Bindung an das VP1 gezeigt werden. In ersten Bindungsstudien wurden in Kooperation mit Prof. Stehle und seinem Team die Calix[n]aren-Oligomere mit dem VP1 cokristallisiert und an einem Synchrotron vermessen. Hierbei hat sich gezeigt, dass es zur Bindung einzelner Neu5Ac kommt, allerdings keine genauen Aussagen über die Bindungsstudien getroffen werden können. Sugars, also known as glycans, are essential building blocks of all organisms. A large number of different glycans are present on cell surfaces in particular. This glycan layer is called the glycocalyx and consists of glycoproteins, glycolipids or proteoglycans. These act as signal transmitters in numerous biological processes, such as cell-cell communication and cell adhesion. Pathogens also utilize the glycocalyx and the sugar-mediated binding of a pathogen to the cell surface is often the first step in the infection process. In order to understand the biological processes in the body on the one hand and the infection mechanism of pathogens on the other, it is of interest to investigate the structure and interaction of glycans. Neuraminic acid (Neu5Ac) is a glycan motif that is used by many pathogens, especially viruses, to bind to cells. This sugar is also involved in many other biological processes. Since the isolation of Neu5Ac-containing glycans and glycan conjugates is complicated, an alternative approach is the generation of so-called glycan mimetics, which can be used as models to study the biological function of glycans. A widely used approach is to restrict the complex natural glycan ligands to the minimal binding motif. Here, all carbohydrate units that are presumably not directly involved in binding are neglected. The remaining carbohydrate ligands are then attached to an artificial scaffold in order to achieve binding reinforcement via this multivalent presentation. The aim of the present work was to establish three different methods for the functionalisation of variable but at the same time structurally defined and multivalent scaffolds with Neu5Ac. Both chemical and enzymatic methods were used for this purpose. One of the already established enzymatic methods is the exo-enzymatic labelling system of NmCSS and PmST1 for the sialylation of galactose units. Recently, Konietzny from the Hartmann working group discovered that, in addition to the targeted sialylation of galactose-functionalised structures, sialylation of the Tris buffer also occurs. This discovery enables a simple chemoenzymatic synthesis of non-glycan-based Neu5Ac derivatives based on natural and non-natural substrates for biological and medical applications. For this reason, the chemoenzymatic synthesis of novel Neu5Ac derivatives was investigated in the first part of this thesis. In particular, the focus was on the sialylation conditions, a screening of different substrate classes (tris-, glycerol-, ethylene glycol-, polyol-based) and the isolation of the sialylated substrates. It was shown that substrates with at least two hydroxyl groups in close proximity can be sialylated. It was also shown that electron-donating and electron-rich functional side chains favour sialylation. The isolation of the sialylated derivatives was achieved using a GPC optimised for low-molecular substances. In addition, initial experiments were carried out for the synthesis of Neu5Ac-functionalised Tris copolymers. In the second part, the possibility of DNA-mediated conjugation was investigated instead of enzymatic covalent linkage of the oligo(amidoamine) scaffolds and sialic acid. In a collaboration with Prof. Kjems and his team, oligo(amidoamine) scaffolds were functionalised several times with oligonucleotide side chains. These are part of the so-called holiday junctions, an X-shaped DNA origami motif. In the present study, one to three holiday junctions were successfully conjugated and isolated by self-assembly on a coumarin-labelled oligo(amidoamine) scaffold. In the future, sialic acids can be attached to the oligonucleotide segments to enable sequence-defined, multivalent presentation. In the third part of the work, calix[n]arene scaffolds (n=4 and 5) synthesised by Alisa Kayser were made available and functionalised via chemical conjugation using Cu-mediated azide-alkyne reaction with sialic acids. For this purpose, three calix[5]arene oligomers with different bond distances and valence of Neu5Ac and one calix[4]arene oligomer were synthesised. The resulting ligands present five or ten Neu5Ac and are orientated towards the pentameric VP1 capsid protein of the Merkel cell polyomavirus (MCPyV) in terms of their size and arrangement of the glycan fragments. MCPyV is the first known oncovirus of the polyomaviruses. It is known that only cells functionalised with Neu5Ac can be infected by MCPyV. The VP1 capsid protein consists of a symmetrical, ring-shaped homopentamer of five VP1 subunits that can bind Neu5Ac. Binding to VP1 has already been demonstrated for flexible linear ligands. In initial binding studies, the calix[n]arene oligomers were co-crystallised with VP1 and measured at a synchrotron in cooperation with Prof. Stehle and his team. This showed that the binding of individual Neu5Ac occurs, but no precise statements can be made about the binding studies.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Organische Chemie und Makromolekulare Chemie
Dokument erstellt am:	03.07.2025
Dateien geändert am:	03.07.2025
Promotionsantrag am:	18.03.2025
Datum der Promotion:	23.05.2025