Dokument: Function of the purinergic receptor P2X7 in MVA-infected feeder cells during MVA cross-presentation

Titel:	Function of the purinergic receptor P2X7 in MVA-infected feeder cells during MVA cross-presentation
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=69670
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20260612-083126-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Longo, Ylenia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,80 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.05.2025 / geändert 18.05.2025
Beitragende:	Prof. Dr. Drexler, Ingo [Gutachter] Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter]
Stichwörter:	Modified Vaccinia Virus Ankara, P2RX7, Cross-presentation, Antigen presentation, Innate signaling
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Modifizierte Vaccinia Virus Ankara (MVA) wird derzeit als sicherer Impfstoffkandidat eingesetzt, der starke angeborene und adaptive Immunreaktionen auslöst. Es ist jedoch nicht viel darüber bekannt, wie diese initiiert oder reguliert werden. Ein Mechanismus, auf den starke und langlebige CD8+ T-Zell-Antworten nach einer MVA-Infektion zurückzuführen sind, ist die Kreuzpräsentation von MVA-Antigenen. Im Allgemeinen gibt es nur wenig Forschung darüber, wie dieser Prozess durch „Feeder Zellen“ ausgelöst wird, also Zellen, die nicht Antigen-präsentierende Zellen sind. Wir haben kürzlich entdeckt, dass der Stimulus für die Auslösung dieser auf Kreuzpräsentation beruhenden adaptiven Immunantworten, anders als bisher angenommen, von den MVA-infizierten „Feeder Zellen“ ausgeht. Bei der Analyse des angeborenen Immunsystems in Cloudman (CM) „Feeder Zellen“ haben wir die mögliche Bedeutung des Rezeptors P2X7 (P2RX7) entdeckt. Dieser Oberflächenrezeptor wurde lange Zeit für einen Teil des Initiatorkomplexes zur Aktivierung des Inflammasoms gehalten. Erst jüngste Studien haben gezeigt, dass er an der Aktivierung einer Vielzahl von nachgeschalteten Signalwegen beteiligt sein könnte. Daher war es unser Ziel, die Beteiligung der P2RX7-abhängigen Signalwege in MVA-infizierten „Feeder Zellen“ zu analysieren und zu untersuchen, wie diese Mechanismen möglicherweise die Kreuzpräsentation durch dendritische Zellen beeinflussen. Zunächst erzeugten wir eine CM-Zelllinie, die den funktionellen P2RX7-Rezeptor von BALB/c Mäusen beherbergt. Wir bestätigten die P2RX7-spezifischen Funktionen dieser Zellen, d. h. Membran-Blebbing, Kalziumeinstrom und Auswirkungen auf den mitochondrialen Stoffwechsel nach MVA-Infektion. Darüber hinaus analysierten wir die Auswirkungen der aktiven P2X7-Rezeptorvariante in CM „Feeder Zellen“ bei der Co-Kultur mit Knochenmark abgeleiteten dendritische Zellen -(BMDCs) und CD8+ T-Zellen. Das Vorhandensein eines aktiven P2RX7 in „Feeder Zellen“ führte zu einer signifikant verbesserten MVA-vermittelten Antigen-Kreuzpräsentation durch BMDCs, was zu einer erhöhten IFNγ- und TNFα-Produktion von CD8+ T-Zellen sowie zu einer erhöhten Oberflächenexpression des SIINFEKL-Peptids auf dem H2-Kb von BMDCs führte. Es konnte gezeigt werden, dass diese Effekte P2RX7-abhängig waren und durch verschiedene P2RX7-spezifische Funktionen verursacht wurden. Wir vermuten, dass die P2RX7-abhängige Freisetzung extrazellulärer Vesikel, die wichtige regulatorische Strukturen sowie Antigene in Form von mRNA enthalten, an der Verbesserung der adaptiven Immunantwort beteiligt sein könnte. Wir nehmen an, dass sezernierte inflammatorische Zytokine, sowie eine verzögerte virale Genexpression, die nachweislich in MVA-infizierten CM P2RX7 Zellen vorhanden sind, dazu führen können, Antigene in viralen Replikationskomplexen einzufangen. Das könnte für eine verbesserte Kreuzpräsentation von Vorteil sein. Wir waren nicht in der Lage, diese Ergebnisse mit einem CRISPR/Cas9-vermittelten P2rx7-Knockout-Modell zu bestätigen, was möglicherweise auf die Genähnlichkeit von P2rx7 mit seinem Familienmitglied P2rx4 zurückzuführen ist, und beobachteten womöglich einen Off-Target-Effekt der CRISPR-Endonuklease Cas9. Wir haben jedoch erfolgreich nachgewiesen, dass P2RX7 als Teil der angeborenen Immunantwort in CM „Feeder Zellen“ eine entscheidende Rolle bei der Regulierung adaptiver Immunantworten spielt. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die Rolle von P2RX7 während einer MVA-Infektion und für die Kreuzpräsentation von Antigenen untersucht. Die Erkenntnisse dieser Arbeit sind wesentlich für die weitere Optimierung von MVA-Vektorvakzinen. Weitere Studien sind jedoch erforderlich, um die genauen Mechanismen aufzuklären, wie P2RX7 die Antigengenerierungsprozesse in CM „Feeder Zellen“ und anschließend in Antigen-kreuzpräsentierenden Zellen verändert. Modified vaccinia virus Ankara (MVA) is currently being used as a safe vaccine candidate, inducing strong innate and adaptive immune responses. However, not much is known about how these are initiated or regulated. One mechanism, by which strong and long-lived CD8+ T cell responses upon MVA infection are accounted is the cross-presentation of MVA-derived antigens. In general, there is little research on how this process is triggered by feeder cells, hence, cells that are not antigen-presenting cells. We have recently discovered, that the stimulus for the initiation of these adaptive immune responses, derived from the MVA-infected feeder cells. In the process of analyzing members of the innate immune system in Cloudman (CM) feeder cells, we have discovered the possible importance of the receptor P2X7 (P2RX7). This surface receptor was long thought to be part of the initiator complex of the inflammasome pathway. Recent studies have demonstrated that it might be involved in the kickoff of a variety of downstream signaling routes. Therefore, we aimed to analyze the involvement of a P2RX7-dependent pathway in MVA-infected feeder cells and to investigate how these mechanisms potentially affected cross-presentation by dendritic cells. We first generated a CM cell line harboring the functional P2RX7 receptor from BALB/c mice. We confirmed imminent P2RX7 functions in these cells, hence membrane blebbing, calcium influx, and effects on mitochondrial metabolism upon MVA infection. We further analyzed the impact of the active P2X7 receptor variant in MVA-infected CM feeder cells upon co-culture with bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) and CD8+ T cells. The presence of an active P2RX7 in feeder cells led to a significantly improved MVA-mediated antigen cross-presentation by BMDCs, resulting in increased IFNγ and TNFα production by CD8+ T cells, as well as an increased surface expression of the SIINFEKL peptide on the H2-Kb of BMDCs. These effects were shown to be P2RX7-dependent and could be associated to different P2RX7-specific functions. We assume that P2RX7-dependent extracellular vesicle release, containing important regulatory structures as well as antigens in the form of mRNA might be involved in improving the adaptive immune responses. We additionally assume, that secreted inflammatory cytokines as well as a delayed viral gene expression in CM P2RX7 could trap antigens in viral factories, which were shown to be present in MVA-infected CM P2RX7 cells, might be beneficial for improved antigen cross-presentation. We were not able to corroborate these results using a CRISPR/Cas9 mediated P2rx7 knockout model, possibly accounting for the gene similarity of P2rx7 with its family member P2rx4 and possibly observed an off-target effect of the CRISPR endonuclease Cas9. However, we have successfully demonstrated that P2RX7 as an innate trigger in CM feeder cells plays a crucial role in regulating adaptive immune responses. This is a first-time study of the role of P2RX7 during MVA infection and in the context of cross-presentation, unfolding its function for further improvements of the MVA viral vector. Further studies are required to elucidate the exact mechanisms of how P2RX7 alters antigen-generation processes in CM feeder cells and subsequently in antigen-presenting cells.
Quelle:	Siehe Dissertation
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie
Dokument erstellt am:	12.06.2026
Dateien geändert am:	12.06.2026
Promotionsantrag am:	16.01.2025
Datum der Promotion:	12.05.2025