Dokument: Rev-Independent Export of Intron containing HIV-1 Env mRNAs

Titel:	Rev-Independent Export of Intron containing HIV-1 Env mRNAs
Weiterer Titel:	Rev-unabhängiger Export von Intron- haltigen HIV-1 Env mRNAs
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=69630
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250519-112036-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ritchie, Anastasia Nicole [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,18 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.05.2025 / geändert 13.05.2025
Beitragende:	Prof. Dr. Schaal, Heiner [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Sequences in the HIV-1 late phase genes that lead to the inhibition of gene expression through nuclear retention are labeled as INS (instability) or CRS (cis-acting repressive sequences) elements. Despite extensive investigation on the HIV-1 life cycle, the exact mechanism underlying the nuclear retention of these late phase HIV-1 mRNAs in the absence of Rev is still unknown. We hypothesized that these RNA elements are bound by RNA-binding proteins, which are responsible for retaining these INS/CRS containing mRNAs in the nucleus. Previous research has implicated known RNA-binding proteins both the hnRNP and SR families in nuclear retention and export respectively. The HEXplorer algorithm, originally developed to analyze splicing regulatory sequence elements, can generally distinguish between sequences likely to bind these two protein families without specifying the exact protein. However, given how distinctive the binding regions of these two RNA binding protein families are, we can show that the described CRS/INS elements have a significantly higher probability of binding hnRNP than SR proteins. In this work, mutated HIV-1 subgenomic expression vectors were created, guided by the HEXplorer algorithm to remove potential nuclear retention regulatory elements and introduce potential nuclear export regulatory elements without altering the underlying amino acid sequence. The results of this work show that the HEXplorer optimized HIV-1 env mutant mRNA were exported from the nucleus independent of Rev expression, albeit producing significantly less protein than the wild type env. This work also confirms that these Rev-independent env transcripts are still exported from the nucleus during CRM1 inhibition, hinting towards a switch in the export pathway. Concatenation and shortening of the mutated CRS region showed that while the length of the mutated region contributed to the nuclear export pattern, there were specific regions that exerted more influence on the nuclear export pattern of the transcript than others. Additionally, reduced production of HIV-1 Env protein led to decreased entry of HIV-1 pseudoviral particles despite similar levels of corresponding RNA, and a potential role for Rev in inhibiting NXF1-mediated nuclear export. In addition to highlighting the role of splicing regulatory elements in other aspects of gene expression, the reduced production of HIV-1 Env protein and decreased viral entry suggest that the HIV-1’s complex nuclear export system evolved to provide sufficient Env protein for productive viral entry. Overall, this work provides insight into the interconnected regulation of several gene expression steps and an algorithm that can predict and replicate elements controlling mRNA maturation and expression, in addition to predicting splice site usage. Sequenzen in den HIV-1-Spätphasengenen, die zur Hemmung der Genexpression durch nukleare Retention führen, werden als INS- (Instabilität) oder CRS-Elemente (cis-acting repressive sequences) bezeichnet. Trotz umfangreicher Untersuchungen des HIV-1-Lebenszyklus ist der genaue Mechanismus, der der nukleären Retention dieser Spätphasen-HIV-1-mRNAs in Abwesenheit von Rev zugrunde liegt, noch unbekannt. Wir stellten die Hypothese auf, dass diese RNA-Elemente durch RNA-bindende Proteine gebunden werden, die dafür verantwortlich sind, dass diese INS/CRS-haltigen mRNAs im Zellkern verbleiben. In früheren Untersuchungen wurden bekannte RNA-bindende Proteine sowohl aus der hnRNP- als auch aus der SR-Familie in die Kernretention bzw. den Kernexport einbezogen. Der HEXplorer-Algorithmus, der ursprünglich für die Analyse von Sequenzelementen zur Spleißregulierung entwickelt wurde, kann im Allgemeinen zwischen Sequenzen unterscheiden, die wahrscheinlich diese beiden Proteinfamilien binden, ohne das genaue Protein zu spezifizieren. Da die Bindungsregionen dieser beiden RNA-bindenden Proteinfamilien jedoch sehr unterschiedlich sind, können wir zeigen, dass die beschriebenen CRS/INS-Elemente eine deutlich höhere Wahrscheinlichkeit haben, hnRNP- als SR-Proteine zu binden. In dieser Arbeit wurden mutierte subgenomische HIV-1-Expressionsvektoren erstellt, die durch nach der HEXplorer- Vorhersage generiert wurden, um potenzielle regulatorische Elemente für die Kernretention zu entfernen und potenzielle regulatorische Elemente für den Kernexport einzuführen, ohne die zugrunde liegende Aminosäuresequenz zu verändern. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die mit HEXplorer optimierte HIV-1 env-Mutanten mRNA unabhängig von der Rev-Expression aus dem Zellkern exportiert wird, wenngleich sie deutlich weniger Protein produziert als der Wildtyp env. Diese Arbeit bestätigt auch, dass diese Rev-unabhängigen env-Transkripte auch während der CRM1- Hemmung aus dem Zellkern exportiert werden, was auf eine Änderung des Exportweges hindeutet. Die Verkettung und Verkürzung der mutierten CRS-Region zeigte, dass die Länge der mutierten Region zwar zum Kernexportmuster beiträgt, es aber bestimmte Regionen gibt, die einen größeren Einfluss auf das Kernexportmuster des Transkripts haben als andere. Darüber hinaus führte eine verringerte Produktion des HIV-1 Env- Proteins zu einem verringerten Eindringen von pseudoviralen HIV-1-Partikeln trotz ähnlicher Mengen an entsprechender RNA, was auf eine mögliche Rolle von Rev bei der Hemmung des NXF1-vermittelten Kernexports hinweist. Die verringerte Produktion des HIV-1 Env-Proteins und der verringerte Eintritt des Virus deuten darauf hin, dass sich das komplexe Kernexportsystem des HIV-1 entwickelt hat, um genügend Env-Protein für einen produktiven viralen Eintritt bereitzustellen. Insgesamt bietet diese Arbeit einen Einblick in die miteinander verbundene Regulierung mehrerer Schritte der Genexpression und einen Algorithmus, der neben der Vorhersage der Nutzung von Spleißstellen auch Elemente vorhersagen und replizieren kann, die die mRNA-Reifung und -Expression
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	19.05.2025
Dateien geändert am:	19.05.2025
Promotionsantrag am:	24.10.2024
Datum der Promotion:	24.04.2025