Dokument: Exploring the process window for production of itaconic, 2-hydroxyparaconic, and itatartaric acid with engineered Ustilago strains

Titel:	Exploring the process window for production of itaconic, 2-hydroxyparaconic, and itatartaric acid with engineered Ustilago strains
Weiterer Titel:	Untersuchung des Prozessfensters zur Produktion von Itaconat, 2-Hydroxyparaconat und Itatartarat mit genetisch modifizierten Ustilago Stämmen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=69569
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250522-110221-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ernst, Philipp [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 17,70 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.05.2025 / geändert 04.05.2025
Beitragende:	Prof. Dr. Wierckx, Nick [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	To combat the current challenges of overpopulation, global warming and the limited availability of fossil resources, the linear petrochemical-based industry needs to be replaced by a more sustainable bioeconomy. Therefore, economic production of bio-based platform chemicals such as itaconic acid is an emerging research topic. Itaconic acid is a versatile monomer in the polymer industry and has also high relevance in the medical and pharmaceutical sectors due to its anti-microbial and anti-inflammatory properties. Up to now, itaconic acid is commercially produced by the fungus Aspergillus terreus, but its filamentous morphology poses major limitations on bioprocess technology developments and elevates production costs. Thus, current efforts are focusing on the dimorphic basidiomycete Ustilago as an alternative, natural itaconic acid producer, which offers several advantages including a stable yeast-like morphology, robustness and biosafety. In previous studies, Ustilago maydis und Ustilago cynodontis have already been deeply engineered to optimize itaconate production. In frame of this thesis, established modifications from two different itaconate-hyperproducing U. maydis strains were consolidated into one strain named U. maydis K14. This strain 1) features stable yeast-like growth due to deletion of fuz7 involved in filamentous development, 2) produces less by-products due to deletion of competing pathways (∆MEL, ∆UA, ∆dgat, ∆cyp3), and 3) circumvents enzymatic bottlenecks by overproduction of the itaconate cluster regulator Ria1 and the mitochondrial cis-aconitate transporter MttA from A. terreus. A lower osmotolerance of U. maydis K14 as a side effect of this engineering was counteracted by a continuous glucose feeding strategy in high and low cell-density fed-batch fermentations. With the latter strategy, high product titers with the maximum theoretical substrate-to-product yield of 0.72 ± 0.02 gITA gGLC-1 during the production phase were obtained, thereby mastering one of the main challenges during fungal itaconate production. However, improving economics is not just about optimizing individual parameters such as yield, titer and productivity, but also about minimizing main cost drivers such as base and acid consumption during fermentation and downstream processing, respectively. Using the previously engineered and naturally acid tolerant U. cynodontis ITA MAX pH (∆fuz7 ∆cyp3 PetefmttA Pria1ria1), the process window of itaconate production with regard to pH was systematically explored in continuous fed-batch fermentations aiming at a rational analysis of operational costs. A subsequent techno-economic analysis exposed that a production pH of 3.6 provided the best trade-off between yield, titer and productivity on the one hand, and the use of base and acid and associated salt waste production on the other hand. While such process optimizations are usually carried out using the conventional feedstock glucose, long-term solutions for bio-based production processes envisage the usage of unprocessed, low-cost feedstocks in order to further reduce production costs and meet the circular bioeconomy concept. In this context, this thesis revealed the natural production of the amylolytic enzymes glucoamylase and α glucosidase by U. cynodontis ITA MAX pH, enabling the utilization of starch as feedstock for itaconate production. Production was optimized by overexpression of an α-amylase gene otherwise not expressed under the applied conditions. In addition to itaconate, Ustilago species produce the two itaconate derivatives 2 hydroxyparaconate and itatartarate, which are potential novel anti-microbial drug candidates. To restore 2 hydroxyparaconate and itatartarate production in U. cynodontis ITA MAX pH, the itaconate-oxidizing P450 monooxygenase gene cyp3 was overexpressed under a constitutive promotor, yielding a product mixture of itaconate, 2 hydroxyparaconate and itatartarate. Derivatives specificity was increased by using glycerol as alternative carbon source, exchanging the native itaconate transporter Itp1 with the one from A. terreus (MfsA), and low pH conditions. In batch fermentations on glycerol, this strain was able to produce 2 hydroxyparaconate and itatartarate with 100 ± 0.0 % derivatives specificity, allowing subsequent purification of both, not yet commercially available products for structural and biochemical characterization. In conclusion, this thesis demonstrates that an integrated approach of strain and process engineering can provide major advances for optimizing economic feasibility of itaconate, 2-hydroxyparaconate and itatartarate production with Ustilago species in a biorefinery context, thereby enabling an expanded production of bio-based building blocks of industrial and potentially also pharmaceutical relevance. Um aktuelle Herausforderungen wie Überbevölkerung, globale Erwärmung und die begrenzte Verfügbarkeit fossiler Ressourcen zu bewältigen, muss die lineare petrochemische Industrie durch eine nachhaltigere Bioökonomie ersetzt werden. In diesem Zusammenhang ist die ökonomische Produktion von biobasierten Plattformchemikalien wie Itaconsäure ein wichtiges Forschungsthema. Itaconsäure ist ein vielseitiges Molekül in der Polymerindustrie und hat aufgrund seiner anti-mikrobiellen und entzündungshemmenden Eigenschaften auch große Bedeutung im medizinischen und pharmazeutischen Sektor. Bisher wird Itaconsäure kommerziell durch den Pilz Aspergillus terreus hergestellt. Jedoch stellt seine filamentöse Morphologie eine große Einschränkung für die Entwicklung von Bioprozesstechnologien dar und trägt zu erhöhten Produktionskosten bei. Daher konzentrieren sich aktuelle Studien auf den dimorphen Basidiomyceten Ustilago als alternativen, natürlichen Itaconsäureproduzenten, der mehrere Vorteile bietet, darunter eine stabile hefeartige Morphologie, Robustheit und biologische Sicherheit. In früheren Projekten wurden Ustilago maydis und Ustilago cynodontis bereits stark modifiziert, um die Itaconat-Produktion zu optimieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden etablierte Modifikationen von zwei verschiedenen Itaconat-hyperproduzierenden U. maydis Stämmen in einem Stamm namens U. maydis K14 konsolidiert. Dieser Stamm zeigt 1) ein stabiles hefeartiges Wachstum durch die Deletion von fuz7, dass an der Filament-Entwicklung beteiligt ist, 2) produziert weniger Nebenprodukte aufgrund der Deletion konkurrierender Stoffwechselwege (∆MEL, ∆UA, ∆dgat, ∆cyp3) und 3) umgeht enzymatische Engpässe durch Überproduktion des Itaconat-Cluster-Regulators Ria1 und des mitochondrialen cis-Aconitat Transporters MttA aus A. terreus. Einer geringeren Osmotoleranz von U. maydis K14 als Nebeneffekt dieser Modifizierungen wurde durch eine kontinuierliche Glukosezufuhr in Fed-Batch Fermentationen unter Hoch- und Niedrigzelldichte-Bedingungen entgegengewirkt. Mit der letztgenannten Strategie konnten hohe Produkttiter mit der maximal möglichen Substrat-zu-Produkt Ausbeute von 0,72 ± 0,02 gITA gGLC-1 während der Produktionsphase erzielt werden, wodurch eine der wichtigsten Herausforderungen der Pilz-basierten Itaconat-Produktion gemeistert wurde. Bei der Verbesserung der Wirtschaftlichkeit geht es jedoch nicht nur um die Optimierung einzelner Parameter wie Ausbeute, Titer und Produktivität, sondern auch um die Minimierung von Kostentreibern wie Base- und Säureverbrauch während der Fermentation bzw. der nachgeschalteten Produktaufarbeitung. Unter Verwendung des zuvor für die Itaconat-Produktion optimierten und von Natur aus säuretoleranten U. cynodontis ITA MAX pH (∆fuz7 ∆cyp3 PetefmttA Pria1ria1) wurde das Prozessfenster für die Produktion von Itaconat in Bezug auf den pH Wert in kontinuierlichen Fed-Batch Fermentationen systematisch untersucht, um eine rationale Analyse der Produktionskosten zu ermöglichen. Eine anschließende techno-ökonomische Analyse ergab, dass ein Produktions-pH-Wert von 3,6 den optimalen Kompromiss zwischen Ausbeute, Titer und Produktivität auf der einen Seite, und dem Verbrauch von Basen und Säuren und der damit verbundenen Produktion von Salzabfällen auf der anderen Seite, darstellt. Während solche Prozessoptimierungen in der Regel mit dem konventionellen Substrat Glukose durchgeführt werden, sehen langfristige Lösungen für biobasierte Produktionsprozesse die Verwendung unverarbeiteter, industrieller Nebenströme vor, um die Produktionskosten weiter zu senken und dem Konzept der zirkulären Bioökonomie zu entsprechen. In diesem Zusammenhang wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass U. cynodontis ITA MAX pH natürlicherweise amylolytische Enzyme wie Glucoamylasen und α-Glucosidasen sekretiert, was die Verwertung von Stärke als Ausgangsmaterial für die Itaconat-Produktion ermöglicht. Durch die Überexpression eines α-Amylase-Gens, welches unter den angewandten Bedingungen normalerweise nicht exprimiert wird, konnte die Produktion optimiert werden. Ustilago produziert neben Itaconat auch die beiden Itaconat-Derivate 2-Hydroxyparaconat und Itatartarat, welche potenziell vielversprechende, neue anti-mikrobielle Wirkstoffe darstellen. Zur Wiederherstellung der Produktion von 2-Hydroxyparaconat und Itatartarat in U. cynodontis ITA MAX pH wurde das Itaconat-oxidierende P450-Monooxygenase Gen cyp3 unter einem konstitutiven Promotor überexprimiert, was zur Bildung eines Gemischs aus Itaconat, 2-Hydroxyparaconat und Itatartarat führte. Die Spezifität der Derivate konnte durch die Verwendung von Glycerin als alternative Kohlenstoffquelle, den Austausch des nativen Itaconat-Transporters Itp1 mit dem aus A. terreus (MfsA) und niedriger pH-Bedingungen gesteigert werden. In Batch-Fermentationen mit Glycerin war dieser Stamm in der Lage, 2-Hydroxyparaconat und Itatartarat mit einer Derivatspezifität von 100 ± 0,0 % zu produzieren, was eine anschließende Aufarbeitung der beiden noch nicht kommerziell erhältlichen Produkte zur strukturellen und biochemischen Charakterisierung ermöglichte. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass durch einen integrierten Ansatz von Stamm- und Prozessentwicklung wichtige Fortschritte erzielt werden können, um die wirtschaftliche Machbarkeit der Produktion von Itaconat, 2 Hydroxyparaconat und Itatartarat mittels Ustilago im Kontext einer Bioraffinerie zu optimieren. Dies ermöglicht eine erweiterte Herstellung von biobasierten Chemikalien mit industrieller und möglicherweise auch pharmazeutischer Relevanz.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	22.05.2025
Dateien geändert am:	22.05.2025
Promotionsantrag am:	07.03.2024
Datum der Promotion:	25.10.2024