Dokument: Charakterisierung von Protein 4.1O als Expressionsprodukt eines Kandidatengens für diabetische Nephropathie unter Berücksichtigung seiner posttranslationalen Modifikationen sowie des Interaktionsverhaltens mit podozytären Proteinen

Titel:	Charakterisierung von Protein 4.1O als Expressionsprodukt eines Kandidatengens für diabetische Nephropathie unter Berücksichtigung seiner posttranslationalen Modifikationen sowie des Interaktionsverhaltens mit podozytären Proteinen
Weiterer Titel:	Characterization of Protein 4.1O as an Expression Product of a Candidate Gene for Diabetic Nephropathy in Consideration of its Post-translational Modifications and Interaction Behaviour with Podocytic Proteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=69513
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250502-131831-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Rieckmann, Sonja [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,69 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.04.2025 / geändert 27.04.2025
Beitragende:	Prof. Dr. med. Sellin, Lorenz [Gutachter] Univ.-Prof. Dr. med. Schott, Matthias [Gutachter]
Stichwörter:	Protein 4.1O, glomeruläre Schlitzmembran, Nephrin, NCK2, diabetische Nephropathie
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die diabetische Nephropathie stellt in Industrienationen die führende Ursache für eine terminale Niereninsuffizienz mit Dialysepflichtigkeit dar und steigert signifikant die Gesamtmortalität von Patienten mit Diabetes mellitus. Genomweite Assoziationsstudien identifizierten einen Zusammenhang zwischen der Auftretenswahrscheinlichkeit des renalen Endorganschadens und dem Vorkommen bestimmter Genvarianten mit der höchsten Odds Ratio für einen SNP in der Nähe des 5‘-Endes von FRMD3. Dessen Genprodukt, 4.1O, ist ein Mitglied der Proteinfamilie 4.1 mit podozytärem Vorkommen. Es zeigt im Tiermodell eine physiologische Relevanz für die Integrität der glomerulären Filtrationsbarriere, da es als Adapterprotein einige Komponenten der Schlitzmembran, unter ihnen Nephrin als deren Hauptstrukturelement, mit dem Aktin-Zytoskelett verbindet. Damit weist es eine funktionelle Ähnlichkeit zu Proteinen der Nck-Familie auf, die gut untersuchte Linkerproteine des Podozyten darstellen. Zur weiteren Charakterisierung des Interaktions- und Bindungsverhaltens von Protein 4.1O sowie dessen posttranslationalen Modifikationen unter hyperglykämen Bedingungen wurden (Co-)Immunpräzipitationen mit anschließendem Western Blotting durchgeführt. Als Expressionstool dienten transient transfizierte HEK 293T Zellen. Nach Modifikation des Standard-Co-IP-Protokolls im Sinne eines zusätzlichen Preclearings durch Ultrazentrifugation wurden die Erkenntnisse rezenter Arbeiten zur Interaktion von 4.1O mit den podozytären Proteinen GLEPP1, IQGAP1 und Nephrin in optimierter Abbildungsqualität verifiziert und die vorbeschriebene Interaktionsdomäne von 4.1O mit Nephrin weiter eingegrenzt. Zudem wurde nachgewiesen, dass NCK2 konzentrationsabhängig die 4.1O/Nephrin-Interaktion schwächt und dass 4.1O vice versa bei Anlagerung an Nephrin dessen interaktionsrelevante Phosphorylierung an den NCK2-Bindungsstellen Y1176/1193 und Y1217 reduzieren kann. In einem ergänzenden Hyperglykämie-Modell ergab sich kein Effekt einer erhöhten Glukosekonzentration auf die Phosphorylierung der posttranslational modifizierbaren Threonine von Protein 4.1O, während eine (nicht signifikante) osmotisch bedingte Abnahme der Tyrosinphosphorylierung gezeigt werden konnte. In Zusammenschau illustrieren die Daten v. a. eine primär über Phosphorylierung regulierte Konkurrenz der beiden strukturell, sowie funktionell ähnlichen Adapterproteine 4.1O und NCK2 um Bindung an die YDxV-Motive von Nephrin. Zellulärer Stress durch Hyperosmolarität, der infolge einer erhöhten Glukosekonzentration entsteht, könnte die 4.1O/Nephrin-Interaktionswahrscheinlichkeit durch 4.1O-Dephosphorylierung reduzieren, vermutlich mit dem Ziel einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts durch bevorzugte Bindung von NCK2 an Nephrin. 4.1O hingegen könnte eher eine Bedeutung im Steady State des Podozyten zukommen. Hier sind zusätzliche Funktionsstudien erforderlich, v. a. auch um die Rolle von 4.1O in der diabetischen Nephropathie weiter zu charakterisieren. Diabetic nephropathy is the leading cause of end-stage renal disease requiring dialysis in industrialized nations and significantly increases overall mortality in patients with diabetes mellitus. Genome-wide association studies identified a connection between the probability of renal end-organ damage and the incidence of certain gene variants with the highest odds ratio for a SNP near the 5’ end of FRMD3. Its gene product 4.1O is a member of the 4.1 protein family which occurs in podocytes. In animal models, it shows a physiological relevance for the integrity of the glomerular filtration barrier because it works as an adapter protein connecting some components of the slit diaphragm, including nephrin as its main structural element, with the actin cytoskeleton. It is functionally similar to proteins of the nck family, which are well-studied linker proteins of the podocyte. For further characterization of the interaction and binding behavior of protein 4.1O and its post-translational modifications under hyperglycemic conditions, (co-)immunoprecipitation followed by Western blotting were performed. Transiently transfected HEK 293T cells served as expression tools. After modifying the standard co-IP protocol by adding a preclearing step consisting of ultracentrifugation, the findings of recent work on the interaction between 4.1O and the podocytic proteins GLEPP1, IQGAP1 and nephrin were verified in optimized figure quality and the previously described interaction domain of 4.1O with nephrin was narrowed down more precisely. It was also demonstrated that nck2 weaks the 4.1O/nephrin interaction in a concentration-dependent manner and that conversely, when attached to nephrin, 4.1O can reduce its interaction-relevant phosphorylation at the nck2 binding sites Y1176/1193 and Y1217. In a supplementary hyperglycemia model, there was no effect of increased glucose concentration on the phosphorylation of the post-translationally modifiable threonines of protein 4.1O, while a (non-significant) osmotically induced decrease in tyrosine phosphorylation was shown. Taken together, these data illustrate a competition between the two structurally and functionally similar adapter proteins 4.1O and nck2 for binding to the YDxV motifs of nephrin, which is primarily regulated by phosphorylation. Cellular stress due to hyperosmolarity, resulting from increased glucose concentration, could reduce the 4.1O/nephrin interaction probability through 4.1O dephosphorylation, presumably aiming a reorganization of the actin cytoskeleton through preferential binding of nck2 to nephrin. On the other hand, 4.1O could be more important in the steady state of the podocyte. Additional functional studies are required here, especially concerning the role of 4.1O in diabetic nephropathy.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	02.05.2025
Dateien geändert am:	02.05.2025
Promotionsantrag am:	21.09.2024
Datum der Promotion:	03.04.2025