Dokument: Harnessing the potential of Pseudomonas putida as a robust platform for the synthesis of bioactive natural products
| Titel: | Harnessing the potential of Pseudomonas putida as a robust platform for the synthesis of bioactive natural products | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=69429 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20250424-105617-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Bitzenhofer, Nora Lisa [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Natural products (NPs) are a valuable source of potentially useful pharmaceutical compounds
and have been a focus of scientific research for a long time. Obtaining these compounds from the native producer is often limited or even impossible, which highlights the significance of recombinant production in appropriate microbial hosts. As Pseudomonas putida has already demonstrated to be a promising heterologous host, this thesis aimed to establish strategies for harnessing the potential of P. putida as a robust production platform for several NPs. First, the criteria identified by prior research for generating a robust Pseudomonas chassis were reviewed and applied in subsequent studies. For stable and straightforward strain generation, a fully modular genetic toolbox was established, which enables the random as well as site-specific chromosomal integration in different genomic loci. This toolbox could be used for the integration of genes encoding biosynthetic pathways and other bioprocess-relevant features in subsequent studies. Pathway engineering was then carried out using the established vector series to genomically introduce genes involved in precursor supply or entire additional precursor biosynthetic pathways. Further, the release and extracellular storage of the produced NP was pursued with different strategies. For the first time, engineering the formation of outer membrane vesicles, a native stress response in Gram-negative bacteria, was explored to support NP biosynthesis in P. putida. Using a two-phase cultivation with polyurethane foam cubes as an adsorbent resulted in the extracellular accumulation of the major part of produced prodiginines and arcyriaflavin A, with over 95% of each compound recovered from the cubes. Finally, access to diverse NPs and their derivatives was enabled by combining biology with classical chemistry to build tailored biosynthetic pathways. Namely, production of new-to-nature hydroxylated and cyclic prodiginines was achieved through a hybrid synthesis route that involves adding chemically prepared building blocks as well as artificial biosynthetic pathway expansion or late-stage chemical conversion of the bioproduct, respectively. This showcase underlined the value of combining different biosynthetic concepts like (combinatorial) biosynthesis, muta-, and semisynthesis. By applying all mentioned strategies, the recombinant production of several NP classes was realized in P. putida KT2440, which include rhamnolipids, terpenes, and especially alkaloids such as prodiginines, violacein, and arcyriaflavin A. In conclusion, genetic as well as biosynthetic tools were established, and engineering strategies were investigated to help to ensure strain stability, to access diverse NPs, and to enhance bioprocess productivity of the chosen host organism. These findings contribute to research aimed at harnessing the potential of P. putida as a recombinant production host and may significantly minimize the effort required to generate an optimal chassis organism hosting novel biosynthetic pathways in the future.Naturstoffe stellen eine bedeutende Ressource für die Entwicklung wichtiger Pharmazeutika dar und befinden sich schon seit längerer Zeit im Fokus der wissenschaftlichen Forschung. Der natürliche Produzent dieser Naturstoffe kann jedoch häufig nicht als Quelle dieser Stoffe dienen, weshalb sich die rekombinante Produktion in einem geeigneten mikrobiellen Wirt als vielversprechende Alternative erwiesen hat. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, verschiedene Strategien zu entwickeln, um Pseudomonas putida, der bereits zuvor als vielversprechender heterologer Wirt beschrieben wurde, als eine robuste Produktionsplattform für diverse Naturstoffe zu etablieren. Hierfür wurden wesentliche Kriterien, die aus der bisherigen Forschung zur Erzeugung robuster Chassis bekannt sind, zusammengetragen und in unterschiedlichen Studien angewandt. Eine modulare Toolbox wurde entwickelt, die sowohl eine zufällige als auch gezielte genomische Integration von Genen, die Biosynthesewege oder andere Bioprozessrelevante Funktionen kodieren, in verschiedene Genom-Loci ermöglicht. Dies wurde in weiteren Studien erfolgreich zur Stammerzeugung eingesetzt. So konnten auch Gene, die an der Synthese von Vorstufenmolekülen beteiligt sind oder sogar ganze alternative Synthesewege kodieren, in das Genom integriert werden, um die Biosynthese der jeweiligen Naturstoffe zu optimieren. Im weiteren Verlauf wurde die Produktivität durch Freisetzung und extrazelluläre Anreicherung des Naturstoffs optimiert, wofür verschiedene Strategien untersucht wurden. Erstmals wurde in P. putida die Bildung von sogenannten outer membrane vesicles, eine natürliche Stressantwort von Gram-negativen Bakterien, gezielt genetisch beeinflusst und ein Einfluss auf die Naturstoffproduktion beobachtet. Außerdem führte eine Zweiphasenkultivierung mit Polyurethanschaumwürfeln als Adsorbens dazu, dass die extrazelluläre Akkumulation von Prodigininen und Arcyriaflavin A erhöht wurde und über 95% der produzierten Menge aller untersuchten Naturstoffe in den Schwämmen zu finden war. Abschließend konnten mithilfe der Kombination aus Biologie und klassischer Chemie maßgeschneiderte Biosynthesewege entwickelt und damit ein Zugang zu verschiedenen Naturstoffen und deren Derivaten ermöglicht werden. Es konnte durch eine hybride Syntheseroute, welche sowohl die Zugabe chemisch hergestellter Vorstufen als auch eine artifizielle Erweiterung des Biosyntheseweges beziehungsweise eine späte chemische Umsetzung des Bioprodukts beinhaltet, die Bildung neuartiger hydroxylierter und zyklischer Prodiginine erreicht werden. Anhand dieses Beispiels konnte verdeutlicht werden, wie vielversprechend die Kombination unterschiedlicher Biosynthesekonzepte wie die (kombinatorische) Biosynthese, Muta- und Semisynthese ist. Durch Anwendung all dieser Strategien konnte die rekombinante Produktion mehrerer Naturstoffklassen in P. putida KT2440 realisiert werden. Diese Klassen umfassen Rhamnolipide, Terpene sowie insbesondere Alkaloide, wie Prodiginine, Violacein und Arcyriaflavin A. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit genetische und biosynthetische Werkzeuge entwickelt sowie engineering-Strategien untersucht, die für die Gewährleistung der genetischen Stabilität der erzeugten Stämme, den Zugang zu verschiedenen Naturstoffen und die Verbesserung der Produktivität des Bioprozesses von zentraler Bedeutung sind. Diese Ergebnisse tragen zur Weiterentwicklung des Potenzials von P. putida als rekombinantem Wirt für die Naturstoffproduktion bei. Die so entwickelten Werkzeuge können helfen, den Aufwand, der für die Entwicklung eines optimalen Chassis-Organismus für neue Biosynthesewege erforderlich ist, erheblich zu reduzieren. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 24.04.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 24.04.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 30.11.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 23.05.2024 |
