Dokument: Structure-function studies of ABC transporters: HlyB from Escherichia coli and ChoX from Sinorhizobium meliloti

Titel:	Structure-function studies of ABC transporters: HlyB from Escherichia coli and ChoX from Sinorhizobium meliloti
Weiterer Titel:	Struktur-Funktionsstudien an ABC Transportern: HlyB aus Escherichia coli und ChoX aus Sinorhizobium meliloti
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6915
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080211-094944-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Oswald, Christine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,90 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.02.2008 / geändert 05.02.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	ATP binding cassette (ABC) transporters represent a superfamily of ubiquitous membrane proteins which utilize energy derived from binding and hydrolysis of ATP to fuel the translocation of substrates. The transport substrates are highly diverse in their chemical characteristics and their size. Generally, this superfamily can be divided in importers and exporters. In contrast to export systems, archaeal and bacterial importers exhibit an additional substrate binding protein (SBP), which captures the substrate and delivers it to the ABC transporter. Binding of the SBP to the transporter triggers ATP hydrolysis and substrate transport. Notably, the substrate specificity of importers is solely determined by the SBP, whereas for exporters the transmembrane domains account for substrate specificity. Haemolysin B (HlyB), an ABC transporter from Escherichia coli, fuels the transport of the 107 kDa toxin HlyA. Together with the membrane fusion protein HlyD and the outer membrane protein TolC this ABC transporter constitutes a type I secretion system, which allows for substrate transport across two membranes in a single step. Central questions for a mechanistic understanding of ABC transporters are how substrate specificity is determined and how substrate binding is triggering ATP binding and hydrolysis. As HlyA is a rather large substrate with respect to the transporter, it is extremely intriguing to unravel the transport mechanism of HlyB. To give an insight into ABC transporter function, a structural determination of HlyB was anticipated. HlyB was successfully overexpressed in Lactococcus lactis and purified to homogeneity by affinity chromatography and gelfiltration. Crystallization studies allowed for the determination of first conditions for a successful HlyB crystallization. The choline transporter ChoXWV from Sinorhizobium meliloti represents an ABC importer. Interestingly, it could be shown in vitro that the SBP binds not only choline but also acetylcholine. Determination of the X-ray structure of the SBP ChoX provided a detailed picture of the molecular determinants of choline and acetylcholine binding. ChoX is composed of two lobes, which together form the substrate binding site consisting of an aromatic box. Comparison of acetylcholine binding with carbamylcholine binding in the nicotinic acetylcholine receptor revealed similarities, which provide first evidence for a common ancestor. Most interestingly, different unliganded structures of ChoX allowed for the identification of a rotational subdomain. Inward rotation of this subdomain upon substrate binding may present a “sensor-transmitter switch”. Only if this “sensor-transmitter switch” is making contacts with the substrate, binding of the SBP to the transporter triggers a series of events leading to ATP hydrolysis and the import of substrate. The proposed “transport triggering mechanism” guarantees that ATP is hydrolyzed only if the binding protein carries substrate. ATP binding cassette (ABC) Transporter bilden eine Klasse von Membranproteinen, die in allen Bereichen des Lebens vorkommen. Die Gewinnung von Energie aus ATP-Bindung und Hydrolyse ermöglicht es diesen Membranproteinen Substrate zu transportieren. ABC Transporter sind in Exporter und Importer unterteilt. Im Gegensatz zu Exportern besitzen Importer eine zusätzliche Untereinheit, das Substratbindeprotein (SBP), welches das Substrat erfasst und es an den Transporter liefert. Die Bindung des SBP an den Transporter selbst induziert ATP-Hydrolyse und Substrattransport. Während bei Exportern die Substratspezifität über die Transmembrandomänen vermittelt wird, geschieht dies bei Importern interessanterweise nur über das SBP. Haemolysin B (HlyB), ein ABC Transporter aus Escherichia coli, energetisiert den Transport des 107 kDa großen Toxins HlyA. Dieser ABC Transporter bildet zusammen mit dem Membranfusionsprotein HlyD und dem äußeren Membranprotein TolC ein Typ I Sekretionssystem, welches das Substrat in einem Schritt über zwei Membranen transportiert. Für ein molekulares Verständnis des Mechanismus von ABC Transportern ist es von besonderem Interesse, die Vermittlung der Substratspezifität zu verstehen. Weiterhin ist der Zusammenhang zwischen Substratbindung und ATP-Hydrolyse ungeklärt. Die Aufklärung des Transportmechanismus von HlyB erscheint besonders interessant, da HlyA im Vergleich zu seinem Transporter, ein sehr großes Substrat darstellt. Um einen Einblick in den ABC Transportmechanismus zu erhalten, sollte HlyB strukturell charakterisiert werden. Dazu wurde es in Lactococcus lactis überexpremiert und mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration zur Homogenität aufgereinigt. Kristallisationsstudien ermöglichten die erfolgreiche Etablierung von Kristallisationsbedingungen für HlyB. Der Cholin Transporter ChoXWV aus Sinorhizobium meliloti gehört der Gruppe der ABC Importer an. In vitro Studien zeigten, dass das SBP dieses Transporters nicht nur Cholin sondern auch Acetylcholin binden kann. Um ein molekulares Verständnis der Bindung von Cholin und Acetylcholin zu erhalten, wurde die Kristallstruktur von ChoX in substratgebundenen Zuständen aufgeklärt. ChoX besitzt zwei Domänen, die gemeinsam die Substratbindestelle bilden und eine aromatische Box generieren. Der Vergleich der Acetylcholinbindung in ChoX mit der Bindung von Carbamylcholin im nikotinischen Acetylcholinrezeptor, zeigt Ähnlichkeiten auf, die erstmals auf einen gemeinsamen Vorläufer hindeuten. Die Strukturbestimmung von ChoX in unterschiedlichen ligandfreien Konformationen erlaubte die Identifizierung einer noch nicht beschriebenen, rotierenden Subdomäne. Da die Subdomäne bei Bindung des Liganden nach Innen rotiert, kann diese als Ligandsensor dienen. Die Interaktion des SBP in ligandgebundenem Zustand mit dem Transporter induziert Veränderungen im Transporter, die letztendlich zur ATP-Hydrolyse führen. Liegt das SBP in ligandfreiem Zustand vor, so verhindert die Subdomäne eine effektive Interaktion mit dem Transporter. Damit kann ATP-Verbrauch reguliert und verschwenderische ATP-Hydrolyse vermieden werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	05.02.2008
Dateien geändert am:	05.02.2008
Promotionsantrag am:	18.12.2007
Datum der Promotion:	23.01.2008