Dokument: Die Selektion und Charakterisierung ungezielt erzeugter Mutanten des Hyphenpilzes Neurospora crassa mit Defekten in der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase
| Titel: | Die Selektion und Charakterisierung ungezielt erzeugter Mutanten des Hyphenpilzes Neurospora crassa mit Defekten in der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6894 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20080211-095144-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Golestani-Asl, Yasmin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter] Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Komplex I Atmungskette Hilfsproteine | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Forschung an dem größten und kompliziertesten Enzym der Atmungskette, der NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I), hat auf Grund seiner prominenten Stellung als Ursache für eine Vielzahl von mitochondrialen Krankheiten und degenerativen Prozessen in den letzten Jahren signifikant zugenommen. Allerdings liegen nur wenige Kenntnisse über die Biogenese und Assemblierung von Komplex I vor. Bislang wurden fünf spezifische Assemblierungsproteine charakterisiert. Da für den weit einfacher strukturierten Komplex IV das Verhältnis von Untereinheiten zu Hilfsproteinen bei etwa 1:1 liegt, ist die Existenz weiterer Assemblierungsproteine von Komplex I anzunehmen. Eine Vielzahl von Hilfsproteinen für die Atmungskettenkomplexe III und IV wurden durch ungezielte Mutagenese in der Hefe Saccharomyces cerevisiae identifiziert.
In dieser Arbeit wurde ein Verfahren zur Erzeugung, Selektion und Charakterisierung von Komplex I-Mutanten mit dem Ziel der weiteren Aufklärung des Assemblierungsmechanismus entwickelt und angewandt. Als Modelorganismus wurde der Hyphenpilz Neurospora crassa gewählt, der im Gegensatz zur fakultativ aneroben Hefe S. cerevisiae einen Komplex I aufweist. Auf Grund seiner verzweigten Atmungskette können in diesem apathogenen Organismus genetische Manipulationen an Komplex I ohne letale Konsequenzen durchgeführt werden. Zur Erzeugung der Mutanten wurde das Verfahren der ungezielten Insertionsmutagenese eingesetzt. Dazu wurde das bar-Gen, welches eine Resistenz gegen das Herbizid Basta vermittelt, in das Genom von N. crassa inseriert. Statistisch wäre für jede 400. Mutante ein Komplex I-Defekt zu erwarten. Da die Überprüfung der enzymatischen Aktivität tausender Mutanten mit einem inakzeptablen Zeit- und Arbeitsaufwand verbunden wäre, besteht die Notwendigkeit für ein vorgelagertes Selektionsverfahren. Eine solche Methode wurde in dieser Arbeit auf der Basis des Wachstumsverhaltens entwickelt. Dazu wurde auf die chinasäureregulierbare Komplex III-Mutante cuco5 zurückgegriffen. Die Erzeugung von Komplex I-Defekten führt in cuco5 zu einer auffälligen Abhängigkeit des Wachstums von Chinasäure. Ein dreistufiges Selektionsverfahren führte zu einer effektiven Reduktion der insgesamt 20.160 untersuchten Transformanden auf 351 chinasäureabhängige Mutanten. Unter diesen wiesen zwölf Mutanten einen spezifischen Komplex I-Defekt auf. In den identifizierten Komplex I-Mutanten wurden insgesamt 15 Insertionsstellen für das bar-Gen durch PCR amplifiziert und sequenziert. Überwiegend liegen die Insertionsstellen in kodierenden Abschnitten. Lediglich in drei Fällen fand die Insertion zwischen zwei Genen statt. Drei der betroffene Gene kodieren bekannte Untereinheiten von Komplex I. Somit ist die Funktionalität und Effektivität des in dieser Arbeit entwickelten Verfahrens gezeigt, da aus der Fülle von Transformanden die gewünschten Mutanten selektiert wurden. Neben den drei betroffenen Genen für Komplex I-Untereinheiten sind in den identifizierten Komplex I-Mutanten insgesamt 14 Gene durch die erfolgte Insertion des bar-Gens entweder direkt betroffen oder liegen benachbart zur Insertionsstelle. Das beobachtete Phänomen der Mehrfachinsertion lässt eine zweifelsfreie Zuordnung der Defekte zu den identifizierten Genen nicht zu, da weitere, unentdeckte Insertionsstellen möglich sind. Durch gezieltes Ausschalten der identifizierten Gene muss daher noch Gewissheit über ihre Rolle bei der Komplex I-Assemblierung gewonnen werden.Research on the biggest and most complicated enzyme of the respiratory chain, the NADH:Ubichinon Oxidoreductase (complex I), has increased significantly over the past years due to its prominent position as cause of a multiple number of mitochondrial diseases and degenerative processes. However, only little is known about the biogenesis and assembly of complex I. So far five specific assembly chaperones have been characterised. As a 1:1 relation of subunits to chaperones has been found in the much simpler constructed complex IV the necessity of more such proteins for the assembly of complex I can be assumed. Multiple chaperones were already identified for the respiratory chain complexes III and IV via undirected mutagenesis in the yeast S. cerevisiae. For a better understanding of the assembly mechanism a method for the generation, selection and characterisation of complex I-mutants has been developed and applied in this thesis. The fungus Neurospora crassa was used as model organism as it forms a complex I in contrast to S. cerevisae. Due to its branched respiratory chain genetic manipulations of complex I can be performed in N. crassa without lethal consequences. The generation of mutants was achieved through undirected insertation mutagenesis. The basta-restistance conferring bar-gene was inserted into the genome of N. crassa. Statistically a defect in complex I was expected for every 400th mutant. As the determination of the enzymatic activity of thousands of mutants would require unacceptable time and effort a preceding selection is needed. Such a method has been developed on the basis of the growth behaviour. For this purpose the quinic acid regulated complex III mutant cuco5 was used. The generation of complex I defects in these mutants leads to a significant growth dependence on quinic acid. An effective reduction of the 20.160 examined transformands to 351 quinic acid dependent mutants was achieved through a three-step screening procedure. Twelf of these mutants showed a specific complex I defect. In the identified complex I mutants 15 insertion sites of the bar-gene have been amplified via PCR and sequenced. The insertion sites are mainly located in encoding domains. Only in three cases the insertion occured between two genes. Three of the effected genes are encoding known subunits of complex I. Therefore the functionality and effectivity of the developed procedure have been proven as the desired mutants were selected out of the high number of transformands. Apart from the three effected genes for complex I subunits another 14 genes are either directly affected or adjacent to the insertation of the bar-gene. The observed phenomenon of multiple insertations doesn’t allow a clear assignment of defects to the identified genes as further unidentified insertations are possible. To achieve certainty about the role in the assembly of complex I the direct knock-out of the identified genes is necessary. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 01.02.2008 | |||||||
| Dateien geändert am: | 01.02.2008 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 14.12.2007 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.01.2008 |
