Dokument: Wirkung von genotoxischen und nicht-genotoxischen Nephrotoxinen auf Differenzierungs- und Dedifferenzierungsprozesse von proximalen Tubulusepithelzellen der Niere

Titel:	Wirkung von genotoxischen und nicht-genotoxischen Nephrotoxinen auf Differenzierungs- und Dedifferenzierungsprozesse von proximalen Tubulusepithelzellen der Niere
Weiterer Titel:	Effect of genotoxic and non-genotoxic nephrotoxins on differentiation and dedifferentiation processes of renal proximal tubular epithelial cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=68828
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250304-112123-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mboni Johnston, Isaac Musong [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,29 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.02.2025 / geändert 27.02.2025
Beitragende:	Frau Prof. Dr. Nicole Schupp [Betreuer/Doktorvater] Herr Prof. Dr. Rainer Kalscheuer [Rezensent]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkungen bekannter Toxine auf die Differenzierungs- und Dedifferenzierungsprozesse von proximalen Tubulusepithelzellen (PTECs) der Niere. PTECs sind ständig potenziell schädlichen Metaboliten und Xenobiotika ausgesetzt, die zu Zelltod und akuter Nierenschädigung (AKI) führen können. Das Regenerationspotenzial der Niere ermöglicht den Ersatz geschädigter Zellen entweder durch Stammzelldifferenzierung oder die Wiedererlangung der proliferativen Eigenschaften der PTECs. Es ist jedoch bekannt, dass die Nierenfunktion abnimmt, was darauf hindeutet, dass die geschädigten Zellen nicht durch voll funktionsfähige Zellen ersetzt werden. Um die möglichen Ursachen für diesen offensichtlichen Verlust der Nierenzellfunktion zu verstehen, ist es wichtig, die Rolle der Toxine während des Regenerationsprozesses zu klären. Unser Ziel war es daher, Modelle menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs) zu etablieren, die sich in proximale tubuläre epithelähnliche Zellen (PTELCs) differenzieren, um die beiden tubulären epithelialen Regenerationswege in vitro zu rekapitulieren, und diese Modelle zu nutzen, um die Reaktionen der Zellen in verschiedenen Stadien der Regeneration auf ausgewählte Toxine zu untersuchen, darunter das genotoxische Nephrotoxin Cisplatin, das nicht-genotoxische Nephrotoxin Cyclosporin A (CsA) und die Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid (H2O2), Menadion und tert-Butylhydrochinon (TBHQ). Im ersten Modell, das zur Regeneration von PTECs aus der Stammzelldifferenzierung verwendet wurde, wurden hiPSCs innerhalb von 9 Tagen erfolgreich in PTELCs differenziert. PTELCs wiesen ausgeprägte morphologische Merkmale auf, zeigten eine verstärkte Expression von typischen Markern und Transportern, die in PTECs vorkommen, und wiesen funktionelle Eigenschaften von PTECs auf. Dazu gehörten der durch Megalin/Cubulin und organische Anionentransporter vermittelte Transport, die P-Glykoprotein-Effluxfunktion und ein trans-epithelialer elektrischer Widerstand von 100 Ωcm2, der der etablierten PTEC-Zelllinie RPTEC-TERT1 sehr ähnlich ist. Bei Behandlung mit bekannten Toxinen zeigten hiPSCs und differenzierte hiPSCs die gleiche Empfindlichkeit gegenüber Cisplatin, obwohl sie unterschiedliche Proliferationsraten aufwiesen, während differenzierte PTELCs, die die niedrigste Proliferationsrate aufwiesen, nicht so empfindlich waren. Im Gegensatz zu Cisplatin zeigten Zellen aller drei Differenzierungsstadien eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber CsA. Beide Toxine hatten jedoch eine hemmende Wirkung auf die funktionelle Fähigkeit der differenzierten PTELCs zur Aufnahme von Albumin. Überraschenderweise waren differenzierte hiPSCs anfälliger für oxidativen Stress, der durch alle drei getesteten Oxidationsmittel ausgelöst wurde, als hiPSCs und differenzierte PTELCs. Bei der Untersuchung der Gründe für die Unterschiede in der Toxizität zwischen den verschiedenen Differenzierungsstadien wurden die Gene für die DNA-Reparatur und die antioxidative Abwehr bei differenzierten hiPSCs im Vergleich zu hiPSCs und PTELCs am stärksten herunterreguliert. Dementsprechend induzierten Cisplatin und ionisierende Strahlung (die als Positivkontrolle verwendet wurde) die höchste Anzahl von γH2AX-Foci in Zellen dieses Differenzierungsstadiums. Oxidationsmittel und Cisplatin lösten in allen Differenzierungsstadien Apoptose aus, und CsA induzierte ebenfalls Seneszenz. Die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) wurde am stärksten durch CsA induziert, gefolgt von Cisplatin, während Oxidationsmittel die EMT-Marker nicht in relevantem Ausmaß hochregulierten. Im zweiten Modell, mit dem die Dedifferenzierung von Tubulusepithelien rekapituliert wurde, konnten wir zeigen, dass sich differenzierte PTELCs dedifferenzierten, indem sie ihre Fähigkeit zur Proliferation wiedererlangten und nach einer Woche der Passage einen EMT-Phänotyp annahmen. Interessanterweise wurde dieser EMT-basierte Dedifferenzierungsprozess durch die Behandlung mit Cisplatin und CsA erheblich gestört, wie die Veränderung der Expression von EMT-assoziierten Genen zeigt. Insgesamt lieferten unsere Daten zum ersten Mal Beweise für unsere Hypothese, dass Nephrotoxine und oxidativer Stress die Regeneration von Tubulusepithelien behindern können. Unser Modell der Differenzierung von hiPSCs in PTELCs und der Dedifferenzierung von differenzierten PTELCs durch den Erwerb eines EMT-Phänotyps scheint geeignet, um in zukünftigen Projekten die Auswirkungen von Toxinen auf die Regenerationsprozesse des Nierentubulusepithels weiter zu untersuchen. In this study, we investigated the effects of known toxins on the differentiation and dedifferentiation processes of renal proximal tubular epithelial cells (PTECs). PTECs are constantly subjected to potentially harmful metabolites and xenobiotics, which may lead to cell death and acute kidney injury (AKI). The kidney’s regenerative potential enables the replacement of damaged cells either through stem cell differentiation or the re-acquisition of proliferative properties of the PTECs. However, it is known that kidney function declines, suggesting that the damaged cells are not substituted by fully functional cells. To understand the possible underlying causes of this apparent loss of renal cell function, it is essential to elucidate the role of toxins during the regeneration process. Our aim was, therefore, to establish models of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that differentiate into proximal tubular epithelial-like cells (PTELCs) to recapitulate the two tubular epithelial regeneration pathways in vitro and to use these models to study the responses of cells at different stages of regeneration to selected toxins, including the genotoxic nephrotoxin cisplatin, the non-genotoxic nephrotoxin cyclosporin A (CsA) and the oxidising agents hydrogen peroxide (H2O2), menadione and tert-butylhydroquinone (TBHQ). In the first model used to regenerate PTECs from stem cell differentiation, hiPSCs were successfully differentiated into PTELCs within 9 days. PTELCs exhibited distinct morphological features, showed increased expression of typical markers and transporters found in PTECs, and demonstrated functional properties of PTECs. These included megalin/cubulin and organic anion transporter-mediated transport, P-glycoprotein efflux function, and a trans-epithelial electrical resistance of 100 Ωcm2, very similar to the established PTEC cell line RPTEC-TERT1. When treated with known toxins, hiPSCs and differentiating hiPSCs showed the same sensitivity to cisplatin, although they had different proliferation rates, while differentiated PTELCs, which had the lowest proliferation rate, were not as sensitive. In contrast to cisplatin, cells of all three differentiation stages showed similar sensitivity to CsA. However, both toxins had an inhibitory effect on the functional ability of differentiated PTELCs to take up albumin. Surprisingly, differentiating hiPSCs were more susceptible to oxidative stress induced by all three oxidising agents tested than hiPSCs and differentiated PTELCs. When examining the reason for the differences in toxicity observed between the different stages of differentiation, DNA repair and antioxidant defence genes were most downregulated in differentiating hiPSCs compared to hiPSCs and PTELCs. Accordingly, cisplatin and ionising radiation (used as a positive control) induced the highest amount of γH2AX foci in cells of this differentiation state. Oxidising agents and cisplatin induced apoptosis at all differentiation stages, and CsA also induced senescence. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) was most strongly induced by CsA, followed by cisplatin while oxidising agents did not upregulate EMT markers to a relevant extent. In the second model used to recapitulate tubular epithelial dedifferentiation, we showed that differentiated PTELCs dedifferentiated by regaining their ability to proliferate and adopting an EMT phenotype after one week of passage. Interestingly, this EMT-based dedifferentiation process was significantly disrupted by treatment with cisplatin and CsA, as shown by the change in expression of EMT-associated genes. Overall, our data, for the first time, provided evidence supporting our hypothesis that nephrotoxins and oxidative stress can impede tubular epithelial regeneration. Our model of hiPSCs differentiating into PTELCs and differentiated PTELCs dedifferentiating through the acquisition of an EMT phenotype seems suitable for further investigating the impact of toxins on renal tubular epithelial regeneration processes in future projects.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Toxikologie
Dokument erstellt am:	04.03.2025
Dateien geändert am:	04.03.2025
Promotionsantrag am:	13.08.2024
Datum der Promotion:	09.12.2024