Dokument: Analyse der Hepatitis C Virusevolution anhand des Hepatitis C-Virus-Ausbruchs durch kontaminiertes Immunglobulin im Jahre 1979 (Anti-D-Ausbruch)

Titel:	Analyse der Hepatitis C Virusevolution anhand des Hepatitis C-Virus-Ausbruchs durch kontaminiertes Immunglobulin im Jahre 1979 (Anti-D-Ausbruch)
Weiterer Titel:	Analysis of hepatitis C virus evolution based on the hepatitis C virus outbreak caused by contaminated immunoglobulin in 1979 (anti-D outbreak)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=68806
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250305-111608-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kortenbruck, Elias Johannes [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,94 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.02.2025 / geändert 25.02.2025
Beitragende:	Timm, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Bock, Hans [Gutachter]
Stichwörter:	Hepatitis C, Hepatitis C-Virus, HCV, Virus, Evolution, Anti-D, Anti-D-Ausbruch
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Das Hepatitis C-Virus (HCV) bleibt auch im Zeitalter der direkten antiviralen Agenzien ein globales gesundheitspolitisches Problem, unter anderem weil die ausgeprägte genetische Variabilität des Hepatitis C-Virus bis heute die Entwicklung einer wirksamen Impfung gegen das Virus erschwert. Des Weiteren ermöglicht sie die Selektion von Immunevasionsvarianten und trägt damit zur Chronifizierung der Infektion mit der Folge von schwerwiegenden gesundheitlichen Auswirkungen auf die betroffenen Patienten bei. Um die Anpassung des Hepatitis C-Virus an seinen Wirt und die zugrundeliegenden evolutionären Mechanismen zu untersuchen, war das erste Ziel dieser Arbeit die Erstellung einer Sequenzdatenbank mit Proben aus einem großen HCV-Ausbruch in den Jahren 1978/79 („Anti-D-Ausbruch“). In diesem Ausbruch erkrankten rund 3000 Personen an einer Hepatitis C durch eine Exposition mit HCV-infizierten Immunglobulin-Präparaten zur Rhesusprophylaxe. Dadurch, dass diese alle auf eine einzige HCV-positive Blutspenderin zurückgehen, mit deren Blut fünf rhesusnegative Spender zur Gewinnung der Immunglobuline immunisiert wurden, kam es zu einem Single-Source-Ausbruch aus genetisch sehr eng verwandten Hepatitis C-Viren. Wir konnten ein PCR-Protokoll bestehend aus RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und Nested PCR etablieren, mit der sich das HCV-Genom von Core bis NS2/3 in drei Abschnitten zuverlässig amplifizieren und mittels Sanger-Methode sequenzieren ließ. Aufgrund der schlechten RNA-Qualität aus frühen Proben direkt nach Beginn des Ausbruchs war eine Sequenzierung dieser Proben nicht möglich. Bei später gesammelten Proben aus den 90er-Jahren war dieser Effekt weniger stark ausgeprägt. Insgesamt konnten aus Verlaufsproben aus den 2000er Jahren 218 Sequenzen von 138 Patientinnen in einer Sequenzdatenbank zusammengestellt werden, darunter 138 Sequenzen von Core bis NS2. Durch diese sowie vorhandene Sequenzen der Nicht-Struktur-Proteine der entsprechenden Proben konnten 74 komplette HCV-Genome generiert werden. In phylogenetischen Analysen zeigte sich die klare Abgrenzung der HCV-Genome aus der Anti-D-Kohorte von HCV-Referenzsequenzen. Auch die Auftrennung der Isolate in drei Clades, aufgrund von drei in der Infektionsquelle vorliegenden Varianten, konnte eindeutig nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die für den Entry in die Hepatozyten vermutlich wichtige Hypervariable Region 1 und die dortige Anti-D-spezifische Insertion quantitativ und mittels Principal Component Analysis analysiert. Ein signifikanter Zusammenhang zwischen den HLA-Typen und den inserierten Aminosäuren konnte nicht gefunden werden. Um den Einfluss von CD8+-T-Zellen auf die Virusevolution in der Anti-D-Kohorte zu untersuchen, wurde der HLA-Typ von 138 Patientinnen mittels SeqFeatR mit der Virussequenz korreliert; zehn Positionen mit einer statistischen Assoziation zwischen HLA-Typ und Sequenz konnten ermittelt werden. Mit dem MHC I Binding Prediction Tool der Immune Epitope Database (IEDB) konnten diese Positionen neun potenziellen T-Zell-Epitopen zugewiesen werden. Zwei wurden bereits in früheren Arbeiten beschrieben, drei weitere wurden im Zusammenhang mit anderen HLA-Typen beschrieben. Die restlichen vier potenziellen Epitope könnten neue Epitope darstellen und müssten in weiteren Arbeiten in vitro bestätigt werden. Zusammenfassend konnten in dieser Studie weitere vollständige HCV-Genome aus der Anti-D-Kohorte entschlüsselt werden. Die phylogenetischen Analysen bestätigten frühere Studien und bei der Analyse der HVR konnte die Anti-D-typische Insertion weiter untersucht werden. Durch statistische Analysen konnten potenzielle T-Zell Epitope identifiziert werden. Even in the age of direct antiviral agents, the hepatitis C virus (HCV) remains a global health problem, partly because the pronounced genetic variability of the hepatitis C virus still makes it difficult to develop an effective vaccine against the virus. Furthermore, it enables the selection of immune evasion variants, which contributes to the chronicity of the infection with serious health consequences for the affected patients. In order to investigate the adaptation of the hepatitis C virus to its host and the underlying evolutionary mechanisms, the first aim of this work was to create a sequence database with samples from a large HCV outbreak in 1978/79 (“anti-D-outbreak”). In this outbreak, around 3000 people contracted hepatitis C through exposure to HCV-infected immunoglobulin preparations for rhesus prophylaxis. The fact that these preparations all originated from a single HCV-positive blood donor, whose blood was used to immunize five rhesus-negative donors to obtain the immunoglobulins, resulted in a single-source outbreak of genetically very closely related hepatitis C viruses. In the first phase of the project, we were able to establish a PCR protocol consisting of automated RNA extraction, cDNA synthesis/reverse transcription and subsequent nested PCR, with which the HCV genome from Core to NS2/3 could be reliably amplified in three sections and then sequenced using the Sanger method. Due to the poor RNA quality of early samples taken directly after the outbreak began, sequencing these samples was not possible. This effect was less pronounced in samples collected later in the 1990s. Using follow-up samples from the 2000s, a total of 218 sequences from 138 patients were compiled in a sequence database, including 138 sequences from Core to NS2. Using these as well as corresponding sequences of the non-structural proteins from previous work, 74 complete HCV genomes were generated. Phylogenetic analyses showed the clear separation of the HCV genomes belonging to the anti-D cohort from HCV reference sequences. The separation of the isolates into three clades, based on three variants present in the source of infection, was also clearly demonstrated. Furthermore, the hypervariable region 1, which is presumably important for entry into the hepatocytes, and the anti-D-specific insertion there were analyzed quantitatively and by means of principal component analysis. A significant correlation between the HLA types and the inserted amino acids could not be found. To investigate the influence of CD8+ T cells on viral evolution in the anti-D cohort, the HLA type of 138 patients with a known HLA type was correlated with the viral sequence using SeqFeatR. Ten positions with a statistical association between HLA type and sequence were identified. Using the MHC I Binding Prediction Tool of the Immune Epitope Database (IEDB), these positions could be assigned to nine potential T cell epitopes. Two have already been described in previous work, three others have been described, but in connection with other HLA types. The remaining four potential epitopes could represent new epitopes and would need to be confirmed in vitro in further work. In summary, further complete HCV genomes from the anti-D cohort could be deciphered in this study. The phylogenetic analyses confirmed previous studies and the analysis of the HVR allowed further investigation of the anti-D-typical insertion. Statistical analyses identified known as well as potential T-cell epitopes.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie
Dokument erstellt am:	05.03.2025
Dateien geändert am:	05.03.2025
Promotionsantrag am:	05.06.2024
Datum der Promotion:	20.02.2025