Dokument: Interaktion des Sirtuins SIRT4 mit Mikrotubuli und Komponenten des γTUSC (GCP2/3) Komplexes

Titel:	Interaktion des Sirtuins SIRT4 mit Mikrotubuli und Komponenten des γTUSC (GCP2/3) Komplexes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=68522
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250218-111842-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bross, Christoph [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2025 / geändert 09.02.2025
Beitragende:	PD Dr. Reza Ahmadian [Gutachter] Prof. Dr. Brenneisen, Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Sirtuine fungieren hauptsächlich als Deacetylasen, Deacylasen und ADP-Ribosyltransferasen. Insbesondere SIRT4 konnte dabei als Effektorprotein identifiziert werden, welches im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion und zellulärer Seneszenz steht. SIRT4 fungiert als Tumorsuppressor, wobei in vielen Tumoren die Expression runterreguliert ist. Es konnten extramitochondriale Bindungspartner von SIRT4 identifiziert werden, z.B. GCP2 und GCP3, welche entscheidend sind für den Zellzyklus. Sie formen den gamma-Tubulin Small Complex, welcher entscheidend für die Rekrutierung des gamma-Tubulin Ring Complex (gTuSC) ist und damit für die Ausbildung und Stabilisierung der Mikrotubuli an den mitotischen Zentrosomen. Die Interaktion von GCP2/GCP3 mit SIRT4 wurde in dieser Arbeit verifiziert. Zusätzlich konnte eine subzelluläre Ko-Lokalisation von SIRT4 mit GCP2/GCP3 am Zentrosom sowie am mitotischen Spindelapparat durch konfokale Laserscanning- Mikroskopie nachgewiesen werden. Schließlich konnte durch Mikrotubuli-Pulldown gezeigt werden, dass SIRT4 (i) an polymerisierte Mikrotubuli bindet und (ii) in a- Tubulin Ko-Immunopräzipitations-Experimenten mit a-Tubulin interagiert. Um den Einfluss von SIRT4 auf die mitotische Zellteilung zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit transient transfizierte SIRT4-eGFP exprimierende HeLa-Zellen mit Hilfe eines reversiblen CDK1-Inhibitors in der G2-Phase arretiert. Nach Wiedereintritt in den Zellzyklus konnte gezeigt werden, dass es bei diesen Zellen zu einer deutlichen Verlangsamung der Mitose kommt im Vergleich zu eGFP exprimierenden Kontrollzellen. Diese Befunde führten zu einem Arbeitsmodell, das die Verzögerung der Mitose durch eine Bindung von SIRT4 zunächst an a-Tubulin Monomere vermittelt wird, welche im Anschluss durch den gTuSC an das Minus-Ende der Mikrotubuli rekrutiert werden und dort Einfluss auf die Funktion des mitotischen Spindelapparates nehmen. Um diese Hypothese näher zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen mit GCP3-spezifischen lentiviralen shRNA-Konstrukten transfiziert und selektiert. In ersten Analysen zeigte sich eine signifikante Runterregulation der GCP3 Proteinmengen und dessen zentrosomaler Lokalisation. Zukünftige Untersuchungen sollten insbesondere die konfokalmikroskopische Überprüfung der zentrosomalen Lokalisation von SIRT4 in Abhängigkeit von GCP3 und dem gTuSC zum Ziel haben. Sirtuins function mainly as deacetylases, deacylases and ADP-ribosyltransferases. SIRT4 in particular has been identified as an effector protein associated with mitochondrial dysfunction and cellular senescence. SIRT4 acts as a tumour suppressor, whereby its expression is downregulated in many tumours. Extramitochondrial binding partners of SIRT4 have been identified, e.g. GCP2 and GCP3, which are crucial for the cell cycle. They form the gamma-tubulin small complex, which is crucial for the recruitment of the gamma-tubulin ring complex (gTuSC) and thus for the formation and stabilisation of microtubules at the mitotic centrosomes. The interaction of GCP2/GCP3 with SIRT4 was verified in this study. In addition, a subcellular colocalisation of SIRT4 with GCP2/GCP3 at the centrosome as well as at the mitotic spindle apparatus could be detected by confocal laser scanning microscopy. Finally, microtubule pull-down demonstrated that SIRT4 (i) binds to polymerised microtubules and (ii) interacts with a-tubulin in a tubulin co-immunoprecipitation experiments. To investigate the influence of SIRT4 on mitotic cell division, transiently transfected SIRT4-eGFP expressing HeLa cells were arrested in G2 phase using a reversible CDK1 inhibitor. After re-entry into the cell cycle, these cells were shown to undergo a significant slowdown in mitosis compared to eGFP-expressing control cells. These findings led to a working model that the delay in mitosis is mediated by binding of SIRT4 initially to a-tubulin monomers, which are subsequently recruited by the gTuSC to the minus end of the microtubules, where they influence the function of the mitotic spindle apparatus. To investigate this hypothesis in more detail, HeLa-cells were transfected with GCP3-specific lentiviral shRNA constructs and selected. Initial analyses showed a significant downregulation of GCP3 protein levels and its centrosomal localisation. Future studies should focus in particular on the confocal microscopic examination of the centrosomal localisation of SIRT4 in relation to GCP3 and the gTuSC.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	18.02.2025
Dateien geändert am:	18.02.2025
Promotionsantrag am:	04.07.2024
Datum der Promotion:	12.12.2024