Dokument: Untersuchungen zur Differenzierung von hepatischen Sternzellen (HSC) in einen glatten Muskelzell-ähnlichen Phänotyp und deren funktionelle Charakterisierung in einem sphäroidalen Kokulturmodell aus Perizyten und Endothelzellen

Titel:	Untersuchungen zur Differenzierung von hepatischen Sternzellen (HSC) in einen glatten Muskelzell-ähnlichen Phänotyp und deren funktionelle Charakterisierung in einem sphäroidalen Kokulturmodell aus Perizyten und Endothelzellen
Weiterer Titel:	Differentiation of hepatic stellate cells into a smooth muscle cell-like phenotype and their functional characterisation within a spheroidal coculture model with pericytes and endothelial cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6843
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080219-135902-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wirz, Werner [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.01.2008 / geändert 28.01.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Kiefer, Paul [Gutachter] Prof. Dr. Mehlhorn, Hans-Peter Heinz [Gutachter]
Stichwörter:	spheroid, in vitro model, differentiation, smooth muscle cells, hepatic stellate cells, liver sinusoidal endothelial cells, pericytes, angiogenesis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Mitwirkung Myofibroblasten-ähnlicher Zellen als Perizyten bei der fibrotisch bedingten Vaskularisierung und bei der Tumorangiogenese wird im Bereich der Lebersinusoide beo-bachtet. Eine Vermutung ist, dass es sich hierbei um aktivierte HSC handelt, die in vivo bei chronischen Leberschädigungen auftreten und deren Differenzierung zum myofibroblasti-schen Phänotyp im Modell durch In-vitro-Kultivierung auf Plastikschalen erreicht werden kann. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass aktivierte HSC wichtige Voraussetzungen erfüllen, um die im normalen Gefäßsystem von SMC erbrachten Funktionen zu übernehmen und in einem neuartigen Kokulturmodell sowohl mit vaskulären wie auch mit dedifferenzierten sinusoidalen Endothelzellen kapillarähnliche Strukturen bilden konnten. Die im Erscheinungsbild den SMC ähnelnden in-vitro-aktivierten HSC bildeten mit diesen einen gemischten Zellrasen. Enge heterotypische Kontakte deuteten auf eine von den Muskel-zellen her bekannte Bindung über N-Cadherin hin, dessen Expression auch in aktivierten HSC erfolgt und für die Verbindung zu vaskulären Endothelzellen verantwortlich sein soll. Ergän-zend zu den bisher bekannten phänotypischen Übereinstimmungen in den kontraktilen Struk-turen konnten die SMC-typischen Marker SM22a, Calponin, Caldesmon, Smoothelin, ACLP, SM MHC und Myocardin über eine RT-PCR in aktivierten HSC nachgewiesen werden, ACLP und SM MHC damit erstmals außerhalb von Muskelzellen. Ferner konnte gezeigt wer-den, dass mit der Bildung von Angiopoietin-1 eine wesentliche Voraussetzung zur parakrin bewirkten Stabilisierung von Endothelzellen in vaskulären Blutgefäßen erfüllt wurde. Zu-sammen mit weiteren Literaturwerten ließ sich im Expressionsmuster eine weitgehende Über-einstimmung zu SMC erkennen, die eine perizytäre Ausrichtung der Sternzellendifferenzie-rung nahe legt. Mit dem Einbau von isolierten LSEC in Kokultursphäroide konnte das bestätigt werden. Das an vaskulären Zellen entwickelte System hatte sich als ein überzeugendes Inside-out-Modell eines Gefäßes erwiesen, an dem die Aktivierung von ruhenden Endothelzellen bis zur Bildung von Kapillarsprossen studiert werden konnte. Beim Vergleich wurde festgestellt, dass im Ge-gensatz zu konventionellen In-vitro-Assays Endothelzellen in diesem Modell nicht durch sin-gulär migrative Reize angeregt werden konnten. Bewirkt werden könnte das durch verstärkte Zell-Zell-Kontakte an der Sphäroidoberfläche, worauf eine gleichzeitig hohe Cadherin- und ß-Catenindichte in diesem Bereich deuten. Beim Austausch von vaskulären SMC gegen HSC bildete sich in der Kokultur mit vaskulären Endothelzellen spontan ein gemeinsames Sphäroid, dessen Bildungsgeschwindigkeit durch eine In-vitro-Aktivierung der Leberzellen begünstigt wurde. Analog zu den SMC bildeten die HSC den Kern, dessen äußere Zellen elektronenmikroskopisch sichtbare heterotypische Ver-bindungen zu einer Endothelschicht an der Oberfläche ausgebildet hatten. Eine gegenseitige Beeinflussung zeigte sich einerseits in einer Aktivierung von aSMA in den HSC an der Kon-taktzone, zum anderen in einer Stabilisierung der Endothelzellen bei einem Angiogeneseassay durch Kollageneinbettung der Sphäroide. Der repressive Effekt der aktivierten HSC äußerte sich hier in der Nicht-Induzierbarkeit von Kapillarsprossung durch VEGF und FGF-2 - im Gegensatz zum Solo-EC-Sphäroid - und dürfte neben den zusätzlich zu überwindenden Bin-dungskräften auf die parakrine Wirkung von Ang-1 zurückzuführen sein. Die Ergebnisse die-ser Kokultivierung belegen, dass aktivierte HSC die Fähigkeit besitzen, als Perizyten an vaskulären Strukturen mitzuwirken. Als Partner kommen dabei LSEC in Betracht, die bei chronischen Wundheilungsprozessen oder Metastasierung in die Leber eine synchrone Dedifferenzierung vollziehen, die zur Vaskularisierung der Sinusoide führt. Im gemeinsam gebildeten Sphäroid konnte jedoch keine Interaktion von LSEC und aktivierten HSC festgestellt werden. Zu einer gefäßtypischen An-ordnung kam es selbst nach einer bis zu achttägiger Inkubation nicht und eine Induktion von vaskulären Markern (VWF, CD 31) war nicht nachzuweisen. Dennoch führte die Kollagen-einbettung im Angiogeneseassay zur Ausbildung zahlreicher voluminöser und verzweigter Kapillarsprosse, die durch den Zusatz angiogener Faktoren (VEGF, FGF-2) verstärkt werden konnten. In diesen Sprossen konnte mit VE-Cadherin ein vaskulärer Marker nachgewiesen werden. Eine Kofärbung der beiden Zelltypen zeigte, dass am Aufbau der Kapillaren aktivier-te HSC mit den LSEC zusammenwirkten. Die in diesem In-vitro-Modell vollzogene Anord-nung entspricht damit derjenigen eines Gefäßes mit dedifferenzierten Endothelzellen und Myofibroblasten-ähnlichen Zellen, wie sie in vaskularisierten Sinusoiden vorliegt. Die leichte Induzierbarkeit dieser Kapillarsprosse durch kollagenöse Umgebung kann dazu beitragen, dass die Angiogenese von Metastasen vorwiegend im perizentralen Bereich auftritt und eine Erklärung bieten, weshalb die Zirrhose der Leber das Tumorwachstum extrem begünstigt. The involvement of myofibroblast-like cells as pericytes in fibrotically caused vascularisation and in tumor angiogenesis can be observed in the area of liver sinusoids. These are presumed to be activated hepatic stellate cells (HSC), which appear in vivo in case of chronical liver diseases, and whose differentiation into a myofibroblastic phenotype can be achieved by in vitro cultivation on plastic dishes. In this study I was able to demonstrate, that activated HSC fulfil important preconditions to adopt functions rendered by smooth muscle cells (SMC) in the normal vascular system and were able to form capillar-like structures in a novel coculture model both with vascular and with dedifferentiated sinusoidal endothelial cells (LSEC). Re-sembling SMC in visual phenotype, in vitro activated HSC formed a mixed cell layer with them. Tight heterotypic contacts pointed to a binding via N-Cadherin, as known from muscle cells. N-Cadherin expression also occurred in activated HSC and is assumed to be responsible for the junctions with vascular endothelial cells. In addition to hitherto existing phenotypical concordance in contractile structures the SMC-typic markers SM22a, calponin, caldesmon, smoothelin, ACLP, SM MHC and myocardin were detected by RT-PCR in activated HSC, thus ACLP and SM MHC for the first time beyond muscle cells. Furthermore production of Angiopoietin-1, which is an essential prerequisite for paracrine effected stabilisation of endo-thelial cells in the vascular system, could be demonstrated. Along with further data the ex-pression profile revealed an extensive accordance to SMC, suggesting a pericytal orientation of HSC differentiation. This was confirmed by the integration of isolated sinusoidal liver cells into coculture spheroids. This system, developed with vascular cells, had been proven a con-vincing inside-out model of a vessel, allowing the study of the activation of quiescent endo-thelial cells to the point of forming capillary-like sprouts. Comparison showed, that in this model - in contrast to conventional in vitro-assays - endothelial cells could not be activated by singular migrative stimuli. This may be caused by intensified cell-cell contacts on the surface of the spheroids, indicated by a simultaneous occurring high density of cadherin and b-catenin in this area. By replacing vascular SMC with HSC in coculture with vascular endothelial cells, a joint spheroid was formed spontaneously. The assembling velocity was promoted by in vitro activation of the liver cells. HSC, in analogy to SMC, formed the core, whose outer cells developed heterotypic junctions with an endothelial layer on the surface, visible by elec-tron microscopy. Interaction appeared on the one hand by activation of a-SMA in HSC of the contact zone, on the other hand by stabilisation of endothelial cells in an angiogenesis assay, performed by embedding spheroids into a collagen gel. In this assay, the repressive effect of activated HSC became manifest in non-inducibility of capillary sprouts by VEGF and FGF-2 – contrary to solo-EC-spheroids – and, beside the need to overcome additional cohesion, may be attributed to paracrine effects of Angiopoietin-1. The results of this cocultivation substanti-ate the assumption, that activated HSC have the ability to function as pericytes in vascular structures. LSEC are suitable partners that perform a synchronous dedifferentiation in chroni-cal wound healing processes or metastasis into the liver, leading to vascularisation of the sinu-soids. Yet, in the collectively formed spheroid, no interaction of LSEC and activated HSC could be detected. Even after eight days of incubation there was no vessel-typic alignment, and an induction of vascular markers (VWF, CD 31) could not be found. However, embed-ding into collagen gel in an angiogenesis assay led to the formation of numerous voluminous and branching capillary-like sprouts, that could be increased by adding angiogenic factors (VEGF, FGF-2). Within these sprouts, the vascular marker VE-Cadherin was identified. Co-staining of the two cell types showed activated HSC and LSEC coacting in assembling the capillary. The resulting arrangement in this in vitro model thus resembles that of a vessel with dedifferentiated endothelial cells and myofibroblast-like cells, as existing in vascularised si-nusoids. Easy inducibility of these capillary sprouts by collagenous environment may contrib-ute to the appearance of metastatic angiogenesis predominantly in the pericentral area and offers an explanation for the fact that cirrhosis of the liver promotes tumour growth ex-tremely.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	28.01.2008
Dateien geändert am:	28.01.2008
Promotionsantrag am:	30.04.2007
Datum der Promotion:	21.05.2007