Dokument: Charakterisierung der Interaktion von CSNK1D und GAPVD1 in der circadianen Uhr
| Titel: | Charakterisierung der Interaktion von CSNK1D und GAPVD1 in der circadianen Uhr | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=68299 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20250206-144013-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Grothoff, Anna-Lena [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Reinke, Hans [Gutachter] Prof. Dr. Björn Stork [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Alle Säugetiere besitzen circadiane Uhren, die als integrale zelluläre Bestandteile ihre Rhythmik autonom aufrechterhalten und hierarchisch organisiert sind. Die zentrale Uhr im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) des Hypothalamus wird durch Licht über den retinohypothalamischen Trakt mit der Umwelt synchronisiert. Periphere Uhren in Organen wiederum werden durch den SCN mithilfe neuronaler Verbindungen und Hormonsekretion gestellt. Circadianen Uhren als Element fast jeder ausdifferenzierten Körperzelle liegt ein molekularer Mechanismus zugrunde, der sogenannte molekulare Oszillator. Uhrenproteine steuern dabei ihre eigene rhythmische Genexpression durch negative Rückkopplungsschleifen. Die Aktivatorproteine CLOCK und BMAL1 treiben in der zentralen negativen Rückkopplungsschleife die Expression von Period- und Cryptochrome-Repressorgenen an.
In Vorarbeiten des gastgebenden Labors wurde das Uhrengen Per2 als circadianer Regulator der Autophagie identifiziert. Eine biochemische Reinigung PER2-enthaltender Proteinkomplexe zeigte, dass PER2 mit GAPVD1, einem Regulator kleiner G-Proteine, co-immunopräzipitiert. GAPVD1 wurde darüber hinaus von anderen Arbeitsgruppen in einem Proteinkomplex mit der Caseinkinase CSNK1D gefunden, die ebenfalls mit PER2 interagiert. Die Interaktion von PER2, CSNK1D und GAPVD1 könnte daher eine zentrale Rolle bei der circadianen Regulation der Autophagie spielen. Das Ziel dieser Arbeit war der Nachweis der Protein-Protein-Interaktion von CSNK1D und GAPVD1 sowie deren intrazellulärer Lokalisation. Hierzu wurde der Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet, bei dem durch extrem enge (<40nm) Colokalisation zweier Proteine mikroskopisch detektierbare Signale entstehen. Um im PLA aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten wurden verschiedene Antikörper gegen CSNK1D und GAPVD1 zunächst mittels Immunofluoreszenz hinsichtlich ihrer Antigenaffinität geprüft und deren Spezifität durch siRNA-Knockdown und Western Blot bestätigt. Durch PLA konnte die Interaktion von CSNK1D und GAPVD1 bestätigt werden, die mehrheitlich im Zytoplasma stattfand, während im Zellkern und dessen Peripherie so gut wie keine PLA-Signale auftraten. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Interaktion von CSNK1D und GAPVD1 mithilfe einer von der Co-Immunopräzipitation unanhängigen Methode nachgewiesen werden kann, und dass sie sich hauptsächlich im Zytoplasma abspielt.All mammals have circadian clocks, which are integral cellular components that display autonomous rhythmicity and are organized hierarchically. The central clock in the nucleus suprachismaticus (SCN) of the hypothalamus is synchronized with the environment by light via the retinohypothalamic tract. Peripheral organ clocks, on the other hand, are set by the SCN via neuronal connections and hormone secretion. The circadian clock as an element of most differentiated body cells is based on a molecular mechanism, called a molecular oscillator. Clock proteins regulate their own rhythmic gene expression through negative feedback loops. The activator proteins CLOCK and BMAL1 drive the expression of Per- and Cry- repressor genes in the central negative feedback loop. Previous work of the hosting laboratory identified the clock gene Per2 as a circadian regulator of autophagy. Biochemical purification of PER2-containing protein complexes showed that PER2 co-immunoprecipitates with GAPVD1, a regulator of small G-proteins. GAPVD1 was shown additionally by other research groups to be in a protein complex with casein kinase CSNK1D, which also interacts with PER2. The interaction of PER2, CSNK1D and GAPVD1 could therefore play a central role in the circadian regulation of autophagy. The goal of this work was to demonstrate the protein-protein interaction of CSNK1D and GAPVD1 and their intracellular localization. For this purpose, the Proximity Ligation Assay (PLA) was employed, in which extremely close (<40nm) colocalization of two proteins results in microscopically detectable signals. In order to obtain meaningful results with the PLA, various antibodies against CSNK1D and GAPVD1 were first tested for their antigen affinity by immunofluorescence and their specifity was verified by siRNA knockdown and Western blot. PLA confirmed the interaction of CSNK1D and GAPVD1, which occurred mostly in the cytoplasm, whereas nearly no PLA signals occurred in the nucleus and its periphery. In summary, these results show that the interaction of CSNK1D and GAPVD1 can be demonstrated with a method different from co-immunoprecipitation and that it takes place mainly in the cytoplasm. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Zentralinstitut für Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik | |||||||
| Dokument erstellt am: | 06.02.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 06.02.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 03.11.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 27.06.2024 |
