Dokument: Evolutive Optimierung von Lipasen aus Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Evolutive Optimierung von Lipasen aus Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa
Weiterer Titel:	Optimization of Lipases from Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6818
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080319-082141-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Puls, Michael [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,32 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.01.2008 / geändert 24.01.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Freudl, Roland [Gutachter]
Stichwörter:	Lipase, Gerichtete Evolution, directed evolution, lipase lid
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In dieser Arbeit wurde die Lipase A aus Bacillus subtilis (BSLA) in ihrer Eigenschaft als minimale α/β-Hydrolase als Grundgerüst für die Insertion homologer Strukturelemente aus anderen α/β-Hydrolasen verwendet. Durch diese Insertionen wurden drei unterschiedliche Varianten mit verlängerten Peptidschleifen (loops) in der Umgebung des aktiven Zentrums erzeugt. Diese Peptidschleifen sollten die Substratbindetasche des Enzyms und damit seine katalytischen Eigenschaften signifikant beeinflussen. Die lipolytische Aktivität der Varianten war geringer als die der Wildtyplipase, konnte jedoch in einigen Fällen durch gerichtete Evolution wiederhergestellt werden. Ferner zeigten die Varianten ein deutlich verändertes Substratspektrum. Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit die Grundlage zur Konstruktion eines Baukastensystems gelegt werden, mit dem Strukturelemente in die mimimale α/β-Hydrolase BSLA integriert werden können, um so neue Substratspezifitäten oder Enantioselektivität für die Entwicklung maßgeschneiderter Biokatalysatoren zu erzeugen. In einem komplementären Ansatz wurde die Deckelstruktur der komplexer strukturierten Lipase A aus Pseudomonas aeruginosa (PAL) deletiert. Dies resultierte jedoch im Verlust der lipolytischen Aktivität, was darauf hindeutet, dass die Funktion der eliminierten Peptidschleife über die eines Deckels hinausgeht. Denkbar wäre eine Funktion bei der Proteinfaltung. Weiterhin wurden verschiedene Einzelmutanten der PAL konstruiert, basierend auf vorangegangenen Arbeiten zur gerichteten Evolution der Enantioselektivität des Enzyms. Die Auswirkungen dieser Mutationen sowie einiger ihrer Kombinationen waren zuvor in silico modelliert worden und konnten in dieser Arbeit experimentell aufgeklärt werden. Die Versuche konnten zeigen, dass die Kombination aus rationalem Design und gerichteter Evolution vielversprechende Strategien bereitstellt, um so sensible Eigenschaften wie Substratspezifität oder Stereoselektivität von Enzymen erfolgreich zu optimieren. The Bacillus subtilis lipase A (BSLA), being regarded as a minimal α/β-hydrolase, was applied as a basic scaffold for the insertion of structural elements of other α/β-hydrolases into its protein backbone. Three different variants were created with elongated loops close to the active site to reshape the substrate binding pocket of the enzyme and thus alter its catalytic activities towards different substrate specificities. The specific activities of the variants were somewhat lower than that of the wildtype but could be increased by directed evolution. The variants indeed showed altered substrate preferences, thus laying the groundwork for the construction of tailor-made α/β-hydrolases and a toolbox-like collection of structural building blocks for α/β-hydrolase enzymes, which could be combined rationally or by combinatorial methods. In a complementary approach, the lid of the more complexly shaped lipase A of Pseudomonas aeruginosa (PAL) was deleted from the enzyme. However, this did not yield any active variants, most likely due to the disruption of structural interactions within the enzyme, pivotal to its proper folding and secretion. Furthermore various point mutants of the PAL were constructed, based on previous experimental and theoretical studies regarding the enantioselectivity of the enzyme. The impacts of these single mutations as well as of specific combinations on the enantioselectivity of the enzyme were experimentally elucidated in this study. It could be demonstrated that the combination of rational design and directed evolution provide most successful strategies for the evolution and optimization of such delicate enzyme properties such as substrate specificity and enantioselectivity.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	24.01.2008
Dateien geändert am:	24.01.2008
Promotionsantrag am:	05.10.2007
Datum der Promotion:	12.11.2007