Dokument: Structure analysis of Phospholipase C - A virulence factor from Pseudomonas aeruginosa
| Titel: | Structure analysis of Phospholipase C - A virulence factor from Pseudomonas aeruginosa | |||||||
| Weiterer Titel: | Structure analysis of Phospholipase C - A virulence factor from Pseudomonas aeruginosa | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=68173 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20250129-114121-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Sabharwal, Nishika [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Dr. Labahn, Jorg [Gutachter] Heise, Henrike [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Antibiotikaresistenz bei gramnegativen Bakterien, insbesondere Pseudomonas aeruginosa, stellt eine erhebliche Herausforderung bei der Behandlung von Infektionen dar, insbesondere bei hospitalisierten und immungeschwächten Patienten. Dieses Pathogen sezerniert verschiedene Virulenzfaktoren, darunter Phospholipasen, die eine entscheidende Rolle in seiner Pathogenität spielen.
Diese Studie konzentrierte sich auf die Charakterisierung zweier Phospholipasen, PLCH und PLCN. Beide wurden in *E. coli* exprimiert und mittels fortschrittlicher chromatographischer Techniken gereinigt. Die Integrität der Proteine wurde durch Western Blot, Massenspektrometrie und verwandte Analysen bestätigt, die auch eine posttranslationale Phosphorylierung von PLCH aufdeckten. Strukturelle Untersuchungen identifizierten PLCHR2 als Heterodimer aus PLCH und seinem Chaperon PLCR2 mit einem definierten stöchiometrischen Verhältnis. Biochemische Tests zeigten, dass beide Phospholipasen in der Lage sind, Phospholipide in vitro und in vivo zu hydrolysieren, wobei Threoninreste in ihren aktiven Zentren für die enzymatische Aktivität essenziell sind. Im Gegensatz zu Phospholipasen aus grampositiven Bakterien benötigen diese Enzyme keine Kationen für ihre Aktivität, obwohl bestimmte Ionen deren Funktion leicht verbesserten. Hämolytische Aktivität wurde bei PLCHR2, jedoch nicht bei PLCN beobachtet; Porenbildung in Lipid-Doppelschichten konnte mittels Rasterkraftmikroskopie visualisiert werden. Studien zur strukturellen Stabilität zeigten unterschiedliche Merkmale in der Sekundär- und Tertiärstruktur, wobei PLCHR2 aufgrund der Anwesenheit des Chaperons eine erhöhte Stabilität aufwies. Fortschrittliche Techniken wie Cryo-EM und Röntgenkristallographie lieferten weitere Einblicke in die strukturellen und funktionellen Mechanismen. Diese Forschung stellt die erste detaillierte strukturelle Studie von Phospholipasen eines gramnegativen Bakteriums dar und bietet wichtige Erkenntnisse über ihre enzymatischen Mechanismen und potenziellen Rollen bei der Verstärkung der Pathogenität. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Phospholipasen vielversprechende therapeutische Ziele darstellen. Zukünftige Untersuchungen sollten sich auf die Ko-Kristallisation mit Inhibitoren, Zelltests zur Bestimmung der Lokalisation und die Erforschung ihrer Auswirkungen auf Wirtszellen konzentrieren, um ihre Rolle bei Infektionen zu validieren.Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria, especially Pseudomonas aeruginosa, presents significant challenges in treating infections, particularly in hospitalized and immunocompromised patients. This pathogen secretes various virulence factors, including phospholipases, which play critical roles in its pathogenicity. This study focused on characterizing two phospholipases, PLCH and PLCN. Both were expressed in *E. coli* and purified using advanced chromatographic techniques. Protein integrity was confirmed through Western blotting, mass spectrometry, and related analyses, which also revealed posttranslational phosphorylation of PLCH. Structural studies identified PLCHR2 as a heterodimer of PLCH and its chaperone PLCR2, with a defined stoichiometric ratio. Biochemical assays demonstrated that both phospholipases could hydrolyze phospholipids in vitro and in vivo, with threonine residues in their active sites proving essential for enzymatic activity. Unlike phospholipases from Gram-positive bacteria, these enzymes did not require cations for activity, although certain ions slightly enhanced their function. Hemolytic activity was observed with PLCHR2 but not PLCN, with pore formation in lipid bilayers visualized using atomic force microscopy. Structural stability studies revealed distinct features in secondary and tertiary structures, with PLCHR2 demonstrating enhanced stability, likely due to the presence of the chaperone. Advanced techniques such as cryo-EM and X-ray crystallography provided further insights into their structural and functional mechanisms. This research represents the first detailed structural study of phospholipases from a Gram-negative bacterium, offering critical insights into their enzymatic mechanisms and potential roles in enhancing pathogenicity. These findings suggest phospholipases as promising therapeutic targets. Future investigations should focus on co-crystallization with inhibitors, cellular assays to determine localization, and exploring their effects on host cells to validate their role in infection. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 29.01.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 29.01.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 27.07.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.10.2024 |
