Dokument: Charakterisierung der subzellulären Kolokalisation und Interaktion von SIRT4 mit RAF-Kinasen

Titel:	Charakterisierung der subzellulären Kolokalisation und Interaktion von SIRT4 mit RAF-Kinasen
Weiterer Titel:	Characterization of subcellular colocalization and interaction of SIRT4 with RAF-kinases
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=68031
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250305-073710-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Verhülsdonk, Patrick [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,80 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.01.2025 / geändert 18.01.2025
Beitragende:	Ahmadian, Mohammad Reza [Gutachter] Prof. Dr. Björn Stork [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Sirtuine (1-7) charakterisieren eine Familie multifunktioneller, NAD+-abhängiger Enzyme mit vorwiegend Deacetylase-Aktivität. Die mitochondrialen Sirtuine (SIRT3-5) sind an der Regulation der mitochondrialen Dynamik, d.h. des mitochondrialen fusion-/ fission cycle, und der mitochondrialen Qualitätskontrolle, d.h. der selektiven mitochondrialen Autophagie (Mitophagie), beteiligt. Mechanistisch führt die ektopische Expression von SIRT4 zu einer Hemmung der mitochondrialen fission über eine Inhibition der MAPK (MAP- Kinase) -vermittelten Phosphorylierung des Pro-fission Faktors DRP1. Massenspektrometrische Analysen identifizierten ARAF und CRAF, Mitglieder der RAF Serin/Threonin Kinase Familie im Ras-RAF-MEK-ERK (MAPK) Signalweg, als Interaktionspartner von SIRT4. Basierend auf der Hypothese, dass SIRT4 über die Interaktion mit RAF-Kinasen zu einer Inhibition des MAPK-DRP1-Signalweges und somit zu einer verminderten mitochondrialen fission führt, sollte in dieser Arbeit die mitochondriale Kolokalisation der RAF-Paraloge sowie die SIRT4-RAF-Kinase-Interaktion näher untersucht werden. Mit Hilfe der konfokalen Laserscanning Mikroskopie wurde die subzelluläre Lokalisation von ektopisch exprimierten RAF-Paralogen, die über einen FLAG-Tag detektiert wurden, analysiert. Es zeigte sich, dass ARAF und CRAF im Vergleich zum dritten RAF-Kinase-Mitglied BRAF mit MTC02, einem mitochondrialen Marker, kolokalisieren. Zusätzlich konnte eine Kolokalisation von endogenem ARAF mit MTC02 bestätigt werden. In subzellulären Fraktionierungen waren auf Proteinebene ARAF und CRAF im Vergleich zu BRAF deutlich geringer im Zytosol vorhanden, während in der angereicherten mitochondrialen/ membranären Proteinfraktion höhere Mengen an ARAF/CRAF im Vergleich zu BRAF gefunden wurden. Die massenspektrometrischen Ergebnisse konnten erstmals durch Koimmunopräzipitationsexperimente mit der anti-GFP Nanobody Methode und stabil SIRT4-eGFP exprimierenden HEK293 Zelllinien bestätigt werden. Erste funktionelle Experimente konnten zeigen, dass ein shRNA-vermitteltes Herunterregulieren von ARAF in HEK293-Zellen sowie ein mit der CRISPR-Methode generierter Gen-knockout von CRAF in SKBR3-Zellen jeweils zu einer verminderten Phosphorylierung von pDRP1 (Ser616) führt. Zukünftig bleibt der Einfluss einer erhöhten Expression von SIRT4 (im Vergleich zu dessen zellulären Depletion) auf den Phosphorylierungsgrad von pDRP1 (Ser616) und das mitochondriale Netzwerk/fission genauer zu klären. Sirtuins (1-7) characterise a family of multifunctional, NAD+-dependent enzymes with predominantly deacetylase activity. The mitochondrial sirtuins (SIRT3-5) are involved in the regulation of mitochondrial dynamics, i. e. the mitochondrial fusion/ fission cycle, and mitochondrial quality control, i. e. selective mitochondrial autophagy (mitophagy). Mechanistically, the ectopic expression of SIRT4 leads to an inhibition of mitochondrial fission via an inhibition of MAPK (MAP kinase)-mediated phosphorylation of the pro-fission factor DRP1. Mass spectrometric analyses identified ARAF and CRAF, members of the RAF serine/threonine kinase family in the Ras-RAF-MEK-ERK (MAPK) signalling pathway, as interaction partners of SIRT4. Based on the hypothesis that SIRT4 leads to an inhibition of the MAPK-DRP1 signalling pathway and thus to reduced mitochondrial fission via the interaction with RAF kinases, the mitochondrial colocalisation of the RAF paralogues and the SIRT4-RAF kinase interaction should be investigated in more detail in this study. Confocal Laserscanning microscopy was used to analyse the subcellular localisation of ectopically expressed RAF paralogues that were detected using a FLAG tag. It was shown that ARAF and CRAF colocalise with MTC02, a mitochondrial marker, in comparison to the third RAF kinase member BRAF. In addition, colocalisation of endogenous ARAF with MTC02 was confirmed. In subcellular fractionations, ARAF and CRAF were significantly less present in the cytosol at the protein level compared to BRAF, while higher amounts of ARAF/CRAF were found in the enriched mitochondrial/membrane protein fraction compared to BRAF. The mass spectrometric results were confirmed for the first time by co-immunoprecipitation experiments using the anti-GFP nanobody method and stably SIRT4-eGFP ex-pressing HEK293 cell lines. Initial functional experiments showed that shRNA-mediated downregulation of ARAF in HEK293 cells and CRISPR-induced gene knockout of CRAF in SKBR3 cells both lead to reduced phosphorylation of pDRP1 (Ser616). In the future, the influence of an increased expression of SIRT4 (compared to its cellular depletion) on the phosphorylation level of pDRP1 (Ser616) and the mitochondrial network/fission remains to be clarified in more detail.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II
Dokument erstellt am:	05.03.2025
Dateien geändert am:	05.03.2025
Promotionsantrag am:	04.06.2024
Datum der Promotion:	12.12.2024