Dokument: Loss of Hepatitis B virus HBeAg contributes to immune escape from CD8+ T cells directed against the core-protein

Titel:	Loss of Hepatitis B virus HBeAg contributes to immune escape from CD8+ T cells directed against the core-protein
Weiterer Titel:	Bedeutung des Hepatitis-B-Virus e-Antigen (HBeAg) Verlusts als Mechanismus der CD8+-T-Zell-Evasion
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=67985
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250106-090516-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Damagnez, Maximilian Paul [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 71,67 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.12.2024 / geändert 16.12.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Timm, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Kalscheuer, Rainer [Gutachter]
Stichwörter:	HBV, HBeAg
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The hepatitis B virus is a small, enveloped virus containing a relaxed circular DNA. The virus can cause an acute or chronic infection of the liver. During the acute infection, CD8+ T cells are essential in controlling the ongoing infection. The development of a chronic HBV infection is associated with a failure of the cellular immune response against the virus. During chronic infection, CD8+ T cells exhibit an exhausted or memory-like phenotype. Epitopes in the hepatitis B core region are an important target for HBV-specific CD8+ T cell-directed immune control. The epitopes in the hepatitis B core region could originate from two distinct viral proteins. The core protein, which is translated from the pregenomic mRNA (pgRNA) and forms the viral nucleocapsid, and the N-terminally elongated precore protein, which is translated from a different viral transcript (the precore mRNA) and further processed and secreted as the Hepatitis B virus e-antigen (HBeAg). The HBeAg status is used as an important serological diagnostic marker for disease prognosis and classification of the chronic disease stages. While an HBeAg-positive chronic infection is characterized by high viral loads and weak or even undetectable CD8+ T cell responses, the transition to HBeAg-negative chronic infection (HBeAg seroconversion) is associated with an increase in activation of HBV-specific CD8+ T cells. Upon HBeAg seroconversion, two types of mutations that are associated with decreased HBeAg secretion are frequently selected. The first mutation is located in the basal core promoter (BCP) region of the core promoter responsible for the transcription of the pgRNA and the precore mRNA. The mutation comprises two nucleotide exchanges at position A1762T and G1764A, called the BCP double mutation (BCP mut.). The other mutation associated with HBeAg seroconversion is a mutation in the N-terminal elongation of the precore at position G1896A which introduces a stop codon (W28*). The project aimed to better understand how precore/HBeAg peptides contribute to the epitopes presented on the cell surface. The hypothesis of this work was that loss of HBeAg leads to a decrease in the abundance of epitopes for HBV-specific CD8 T cells, thereby contributing to a CD8+ T cell immune escape. The HBeAg mutations in the Dusseldorf cohort were analyzed, and an HBV cell culture model that uses the covalently closed circular DNA (cccDNA) in HepG2-hNTCP cells as a starting point was established. Sequences from HBV genotype A and D infected patients and inferred consensus sequences were utilized in the HBV cell culture model to test the hypothesis. Furthermore, the cells transfected with the cccDNA were used as targets for CD8+ reporter cells carrying a core- or surface-specific T-cell receptor (TCR). Analysis of the Düsseldorf HBV cohort indicated, besides the two known HBeAg-altering mutations, a predominantly in genotype A occurring third mutation in the start codon of the precore protein. Further, it was shown that in genotype A, a more heterogenous, and in genotype D, a more homogenous distribution of HBeAg-altering mutations was found. In the HBV cell culture assay, all precore mutations decreased HBeAg secretion with quantitative differences between mutations but independend of the HBV genotype. The BCP mutation resulted in a reduction but not a loss of HBeAg, whereas the G1896A stop mutation and the start codon mutation led to a loss of HBeAg. Introducing the reporter cells containing the core-specific TCR into the HBV cell culture model could demonstrate that the loss of HBeAg correlated with a reduction in activation of the reporter cells, whereas this did not affect the reporter cell containing a surface-specific TCR. The results of this project provide evidence that despite the contribution of HBeAg to an immune tolerant state at the beginning of a chronic infection, HBeAg-derived epitopes contribute to the presented peptide repertoire in the tested model system. This discovery is an important step in understanding the viral HBeAg seroconversion and could contribute to developing better therapies with the ultimate goal of a functional cure of HBV infection. Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein kleines, behülltes Virus mit einer zirkulären, überwiegend doppelsträngigen DNA. Eine Infektion mit dem Virus führt beim Patienten zu einer akuten oder auch chronischen Infektion der Leber. In der akuten Phase der Infektion spielen die körpereigenen CD8+ T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle bei der Virusabwehr. Beim Übergang von einer akuten zu einer chronischen HBV-Infektion kommt es zu einem Versagen der zellulären Immunantwort gegen das Virus. Bei der Analyse von CD8+ T-Lymphozyten in chronisch infizierten Patienten dominieren T-Lymphozyten mit einem Phänotyp, der durch Merkmale charakterisiert ist, die auf Erschöpfung oder Gedächtniszellen hinweisen. Betrachtet man die Interaktion von CD8+ T-Lymphozyten mit infizierten Hepatozyten stellen Epitope aus der Core-Region des HBV Genoms ein bedeutendes Ziel dar. Interessanterweise könnten zwei verschiedene virale Proteinquellen als Ursprung der präsentierten Epitope der Core-Region dienen: Zum einen könnten die Epitope vom Core-Protein stammen, das aus der prägenomischen mRNA (pgRNA) translatiert wird und das virale Nukleokapsid bildet. Zum anderen könnten die Epitope vom N-terminal verlängerten Precore-Protein stammen, das aus der precore-mRNA translatiert, anschließend prozessiert und als Hepatitis-B-Virus-e-Antigen (HBeAg) sezerniert wird. Der HBeAg-Status des Patienten dient als wichtiger diagnostischer Marker für die Prognose und Klassifikation der chronischen Hepatitis-B-Erkrankung. Eine HBeAg-positive chronische Infektion ist durch eine hohe Viruslast und geringe bis nicht nachweisbare CD8+ T-Zell-Antworten gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu ist der Übergang zu einer HBeAg-negativen chronischen Infektion (HBeAg-Serokonversion) mit einer verstärkten Aktivierung HBV-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten assoziiert. In HBeAg-negativen chronisch infizierten Patienten können häufig zwei Mutationen im Virus nachgewiesen werden, die mit einer verminderten oder fehlenden HBeAg-Sekretion assoziiert sind. Die erste Mutation befindet sich in der basalen Core-Promotor-Region (BCP) des Core-Promotors, welcher für die Transkription der pgRNA und der precore mRNA verantwortlich ist. Diese Mutation umfasst zwei Nukleotidaustausche an den Positionen A1762T und G1764A und wird als BCP-Doppelmutation (BCP mut.) bezeichnet. Die zweite Mutation führt durch den Austausch eines Guanins durch ein Adenin an Position 1896 (W28*) zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation der precore mRNA. Ziel dieser Arbeit war es, den Beitrag von Precore/HBeAg-Peptiden zu den auf der Zelloberfläche präsentierten Epitopen festzustellen und die Auswirkungen des Verlusts von HBeAg auf die CD8+ T-Lymphozyten-vermittelte Immunantwort zu untersuchen. Für diese Untersuchung musste zunächst ein HBV-Zellkulturmodell etabliert werden. Dabei diente in vitro generierte kovalent geschlossene zirkuläre DNA (cccDNA) als Grundlage, die in HepG2-hNTCP-Zellen eingebracht wurde. Die Fragestellung sollte an Viren der Genotypen A und D untersucht werden, da diese den Großteil der in Deutschland und Europa zirkulierenden HBV-Stämme repräsentieren. Zusätzlich zu den von Patienten gewonnenen Virussequenzen wurden Konsensussequenzen der Genotypen A und D erstellt, um die genetische Diversität angemessen abzubilden. Die Analyse der Düsseldorfer HBV-Kohorte identifizierte, neben den bereits bekannten HBeAg-Mutationen (BCP-Mutation und W28*), eine vorwiegend im Genotyp A auftretende Mutation im Startcodon des Precore-Proteins (Startmutation). Zudem wurde nachgewiesen, dass sich die Genotypen in Bezug auf HBeAg-selektierende Mutationen unterscheiden. Genotyp A zeigte eine heterogene Verteilung, während Genotyp D eine homogenere Verteilung der HBeAg-Mutationen aufwies. In den durchgeführten Experimenten führten alle Precore-Mutationen zu einer Reduktion der HBeAg-Sekretion, wobei quantitative Unterschiede zwischen den einzelnen Mutationen auftraten, jedoch unabhängig vom Genotyp. Die BCP-Mutation bewirkte eine Reduktion, jedoch keinen vollständigen Verlust von HBeAg, während die W28*-Mutation und die Startmutation zu einem vollständigen Verlust von HBeAg führten. Darüber hinaus wurden Zellen, die mit cccDNA transfiziert waren, als Zielzellen für CD8+ Reporterzellen verwendet, welche einen HBV Core- oder HBV Surface-spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) exprimierten. Mittels dieser TCR-Reporterzellen konnte nachgewiesen werden, dass der Verlust von HBeAg mit einer Reduktion der Aktivierung der Core-spezifischen Reporterzellen korreliert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass, obwohl die Anwesenheit von HBeAg ein wichtiges Entwicklungskriterium für die Progression zu einer chronischen Infektion darstellt und zur Immuntoleranz beiträgt, von HBeAg abgeleitete Epitope dennoch maßgeblich zur Präsentation auf der Zelloberfläche beitragen. Diese Entdeckung stellt einen wichtigen Schritt zum Verständnis der viralen HBeAg-Serokonversion dar und könnte zur Entwicklung verbesserter Therapien beitragen, mit dem langfristigen Ziel einer funktionellen Heilung der HBV-Infektion.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	06.01.2025
Dateien geändert am:	06.01.2025
Promotionsantrag am:	20.08.2024
Datum der Promotion:	12.12.2024