Dokument: Elucidating proton coupling in a vesicular glutamate transporter homolog

Titel:	Elucidating proton coupling in a vesicular glutamate transporter homolog
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=67980
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250122-093252-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dmitrieva, Nataliia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 33,53 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.12.2024 / geändert 13.12.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Fahlke, Christoph [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Familie der Solute Carrier 17 (SLC17) ist eine Gruppe von Proteinen, die organische Anionen durch die Membran in Cytoplasma (SLC17A1-4), Lysosomen (SLC17A5 und SLC17A9) oder synaptische Vesikel (SLC17A6-8) transportieren. Sie weisen eine große Vielfalt an Substratspezifität und Transportmechanismen auf. Zusammen mit den anderen 15 SLC-Familien gehören sie zur Major Facilitator Superfamily (MFS). MFS-Proteine zeichnen sich durch ihre ausgeprägte Faltung mit 12 Transmembranhelices (TM) aus, die in zwei pseudosymmetrische Domänen gruppiert sind. Alternating access mechanism umfasst die Bewegung der beiden Domänen um die zentrale Bindestelle, die sie abwechselnd auf beiden Membranseiten freilegt und den Substrattransport ermöglicht. Hier haben wir den Transportmechanismus eines bakteriellen Homologs, des D-Galactonat-Transporters DgoT, mit einer Kombination aus computergestützten und experimentellen Verfahren untersucht. Durch solid-supported membrane electrophysiology konnten wir feststellen, dass jedes Galaktonatmolekül zusammen mit zwei Protonen transportiert wird. Der aktive Transport kann durch alkalische pH-Werte außerhalb der Liposomen aufgrund einer abgeschwächten Protonenbindung oder durch saure pH-Werte innerhalb der Vesikel aufgrund einer beeinträchtigten Protonenfreisetzung gehemmt werden. Die Mutationen D46N, E133Q, R47Q, R126Q und C43A führen zu einem Verlust der Transportaktivität, während die selektive Bindung von Galaktonat weiterhin beobachtet wird. Bei allen Mutanten, mit Ausnahme von R47Q, beobachteten wir eine elektrogene Reaktion, die auf eine schnelle Substratbindung, gefolgt von einer Konformationsänderung des Proteins, zurückzuführen ist. R47 koppelt die Substratbindung mit der Konformationsänderung des Proteins, daher wird in der mutierten Variante nur der erste Schritt nachgewiesen. All-atom molecular dynamics simulations ergaben, dass die Protonierung von D46 und E133 in apo DgoT mit einer Umstrukturierung des Tores (TM1 und TM7) verbunden ist, die den Zugang zur Substratbindestelle von der extrazellulären Seite aus regulieren. Nach der Toröffnung kann Galaktonat die Bindestelle erreichen, wodurch das extrazelluläre Tor geschlossen wird und in die nach innen geöffnete Konformation übergeht, in der das Substrat freigesetzt wird. Mithilfe von Markov state modeling haben wir die Energetik der wichtigsten Konformationsänderungen quantifiziert und gezeigt, dass die Anwesenheit von Galaktonat in der Bindestelle eine nach innen geschlossene Konformation des Proteins fördert, während der apo Transporter einen nach außen offenen Zustand bevorzugt. Auf der Grundlage unserer experimentellen und computergestützten Ergebnisse schlagen wir ein Transportmodell für den Galaktonat/H+-Kotransport in DgoT vor, das Einblicke auf atomarer Ebene in die der Kopplung in SLC17-Proteinen zugrunde liegenden Mechanismen geben kann. Solute carrier 17 (SLC17) family is a group of structurally related proteins that transport organic anions across biological membranes. Members of the family are expressed in the plasma membrane (SLC17A1-4), lysosomes (sialin, or SLC17A5; VNUT, or SLC17A9) and synaptic vesicles (VGLUT1-3, or SLC17A6-8). They exhibit great diversity in substrate specificity and transport mechanism. Together with the other 15 SLC families, they belong to major facilitator superfamily (MFS), the largest superfamily of secondary active transporters. MFS proteins are characterized by their distinct fold with 12 transmembrane helices (TM) that are grouped into two pseudosymmetrical domains. A key element of the transport mechanism is alternating access that involves movement of the two domains around central binding site. Such conformational change interchangeably exposes the binding site to either membrane side and allows substrate transport across the membrane. To better understand how structurally-similar proteins mediate transport of various substrates with different stoichiometries, we investigated transport mechanism of bacterial homologue, d-galactonate transporter DgoT. Despite moderate sequence identity, DgoT is structurally similar to mammalian SLC17 proteins, particularly VGLUTs and sialin. Two crystal structures in different conformations make DgoT an attractive model system to investigate transport mechanisms in coupled transporters. We used a combination of computational and experimental approaches to study DgoT. With solid supported membrane-based electrophysiology, we determined that each galactonate molecule is transported together with two protons. Therefore, pH conditions on both sides of the membrane are important; transport can be inhibited by alkaline pHs outside the liposomes due to attenuated proton binding, or by acidic pH inside the vesicles due to impaired proton release. With site-directed mutagenesis, we characterized roles of individual residues in transport activity. Mutations D46N, E133Q, R47Q, R126Q and C43A lead to loss of transport activity, while selective binding of galactonate remains intact. In all mutants, with the exception of R47Q, we observed an electrogenic reaction that can be attributed to a fast substrate binding followed by a conformational change in the protein. R47 couples substrate binding with the conformational changes in the protein, therefore in the mutant variant only the first step is detected. All-atom molecular dynamics simulations revealed that protonation of D46 and E133 in apo DgoT is coupled with rearrangement of gating helices TM1 and TM7 that regulate access to the substrate-binding site from the extracellular side. After gate opening, galactonate can reach the binding site inducing extracellular gate closure and transition to the inward-open conformation, where the substrate is released. Interaction between galactonate and R47 play an important role in this mechanism, and R47Q DgoT fails to close the gate in the presence of the substrate. Using Markov state modeling, we quantified energetics of major conformational changes and demonstrated that the presence of galactonate in the binding site promotes an inward-occluded conformation of the protein, while apo transporter favors an outward-open state. Based on our experimental and computational results, we propose a transport model for galactonate/H+ co-transport in DgoT, which can provide atomic-level insights into the mechanisms underlying coupling in SLC17 proteins.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	22.01.2025
Dateien geändert am:	22.01.2025
Promotionsantrag am:	18.07.2024
Datum der Promotion:	20.11.2024