Dokument: Physiologische Charakterisierung der Phospholipase PlaF aus Pseudomonas aeruginosa
| Titel: | Physiologische Charakterisierung der Phospholipase PlaF aus Pseudomonas aeruginosa | |||||||
| Weiterer Titel: | Physiological characterization of phospholipase PlaF from Pseudomonas aeruginosa | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=67924 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20241209-105903-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Caliskan, Muttalip [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Pseudomonas aeruginosa, Phospholipase | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | P. aeruginosa ist ein Gram-negatives opportunistisches Humanpathogen und weltweit die häufigste Ursache nosokomialer Infektionen. Aufgrund des ubiquitären Vorkommens und der Fähigkeit, zahlreiche Antibiotikaresistenzen zu entwickeln, stufte die WHO im Jahr 2017 P. aeruginosa in die höchste Prioritätsklasse für die Erforschung und Entwicklung neuer medikamentöser Therapien ein. Die Pathogenität dieses Bakteriums beruht auf einer Vielzahl von Zell-assoziierten und sekretierten Virulenzfaktoren. Diese stehen besonders im Fokus der medizinischen Forschung, da sie alternative Angriffspunkte für neue antimikrobielle Therapien darstellen. Zahlreiche hydrolytische Enzyme, wie beispielsweise Phospholipasen, wurden bereits in P. aeruginosa als Virulenzfaktoren identifiziert. Allerdings kodieren immer noch mehr als 40 Prozent des P. aeruginosa-Genoms für Gene, deren Funktionen noch unbekannt und nicht näher charakterisiert sind.
Das Gen pa2949 (plaF) aus P. aeruginosa kodiert für eine membranverankerte Phospholipase A1, die maßgeblich zur Virulenz des Humanpathogens beiträgt. In ersten Forschungsarbeiten war es gelungen, die 3D-Struktur von PlaF aufzuklären und die Aktivität, die über ein Liganden-vermitteltes Monomer-Dimer-Gleichgewicht reguliert wird, gegen verschiedene Substrate zu spezifizieren. Allerdings ist die genaue physiologische Rolle, durch die PlaF zur Virulenz beiträgt, bislang noch unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von PlaF im physiologischen Kontext näher untersucht. Wie aufgrund der zellulären Lokalisation in der Zytoplasmamembran von P. aeruginosa vermutet, konnte im Rahmen einer vergleichenden Lipidomstudie (WT vs. ΔplaF) eine Beteiligung von PlaF an der Membranlipidhomöostase nachgewiesen werden. P. aeruginosa ΔplaF wies eine deutlich verzögerte lag-Phase bei Wachstumsanalysen unter Stressbedingungen und ein signifikantes Defizit in der Biofilmausbildung im Vergleich zu P. aeruginosa WT auf. Quantitative Proteomstudien unter Biofilmbedingungen zeigten pleiotrope Effekte in P. aeruginosa ΔplaF, die sich in unterschiedlichen Expressionslevels zahlreicher Transporter, Zweikomponentensysteme, Eisenaufnahmesysteme und Biofilm-assoziierten Proteinen widerspiegelten. Das am stärksten beeinflusste Zweikomponentensystem war PprAB, das in P. aeruginosa eine entscheidende Schlüsselrolle beim Wechsel aus der planktonischen zur sessilen Lebensform einnimmt. Darüber hinaus waren in P. aeruginosa ΔplaF nahezu alle Proteine des Pyoverdin-abhängigen Eisenaufnahmesystems niedrig abundant, während Proteine aus alternativen Eisenaufnahmesystemen (Feo-, Pyochelin- und Citrat-System) hoch abundant waren. Insgesamt verdeutlicht die Studie, dass die veränderte Membranlipidhomöostase in P. aeruginosa ΔplaF eine wesentliche Rolle in der Anpassung von regulatorischen Proteinnetzwerken spielt. Um die Regulation der PlaF-Dimerisierung als molekularer Schlüsselvorgang für die Aktivität des Proteins näher untersuchen zu können, wurde das PlaF-basierte TOXGREEN-System entwickelt. Es wurde gezeigt, dass PlaF* (ToxR-PlaF-Fusionsprotein) in vivo dimerisiert. Verschiedene PlaF*-Varianten mit einzelnen Mutationen in der Transmembrandomäne wurden untersucht. Dabei ergaben die Analysen unterschiedliche Auswirkungen auf die Dimerisierung der PlaF*-Varianten. Mithilfe des etablierten PlaF-basierten TOXGREEN-Systems werden zukünftige Analysen zur PlaF-Dimerisierung unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht.The Gram-negative human pathogen Pseudomonas aeruginosa is responsible for the majority of nosocomial infections worldwide. In 2017, the WHO categorized P. aeruginosa in the highest priority class for the urgent research and development of novel drugs. The pathogenicity of this bacterium is linked to a range of cell-associated and secreted virulence factors, which are of particular interest for medical research as they represent alternative targets for novel antimicrobial therapies. Hydrolytic enzymes, such as phospholipases, have already been characterized as virulence factors in P. aeruginosa. However, over 40 percent of the P. aeruginosa genome still encodes genes with unknown function. The gene pa2949 (plaF) from P. aeruginosa was found to encode a novel membrane-bound phospholipase A1, which contributes to bacterial virulence. Initial research led to the resolution of the crystal structure of PlaF and revealed a ligand-mediated monomer-dimer equilibrium dependent on the catalytic activity towards natural phospholipid substrates. However, the precise physiological role by which PlaF contributes to virulence remains unknown and requires further elucidation. The involvement of PlaF in the membrane lipid homeostasis was demonstrated by a comparative lipidome study of the P. aeruginosa WT and ΔplaF strain. Further studies indicated that the early growth phase and the biofilm formation were affected in P. aeruginosa ΔplaF compared with P. aeruginosa WT. Additional quantitative proteomic studies under biofilm conditions revealed pleiotropic effects in P. aeruginosa ΔplaF, by which numerous transporters, two-component systems, iron uptake systems and biofilm-associated proteins were significantly dysregulated. PprAB was the most affected two-component system, which plays a crucial key role in P. aeruginosa to switch from the planktonic to the biofilm lifestyle. Moreover, the pyoverdine-dependent iron uptake system was one of the most downregulated protein networks, whereas proteins from alternative iron uptake systems (feo-, pyocheline- and citrate-system) were highly abundant. In summary, this study highlights that the altered membrane lipid composition affected in P. aeruginosa ΔplaF plays an essential role in the adaptation of the global regulatory protein network. To understand the regulation of PlaF dimerization on the molecular level, a PlaF-based TOXGREEN system has been developed. PlaF* (ToxR-PlaF fusion protein) was shown to dimerise in vivo using the TOXGREEN system. Different PlaF*-variants, by which single mutations in the transmembrane domain were introduced, were also constructed. Further analysis revealed different effects on the dimerization of the PlaF-variants. Using the established PlaF-based TOXGREEN system, future analysis of PlaF-dimerization under different conditions will be enabled. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.12.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 09.12.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 10.01.2024 | |||||||
| Datum der Promotion: | 01.10.2024 |
