Dokument: Etablierung der genetischen Modifikation und Analyse des RNAi-Systems im Brassicaceaen-befallenden Brandpilz Thecaphora thlaspeos
| Titel: | Etablierung der genetischen Modifikation und Analyse des RNAi-Systems im Brassicaceaen-befallenden Brandpilz Thecaphora thlaspeos | |||||||
| Weiterer Titel: | Establishment of the genetic manipulation and analysis of the RNAi system in the Brassicaceae infecting smut fungus Thecaphora thlaspeos | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=67713 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20241204-111833-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Bösch, Kristin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Rose, Laura [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Für gezielten Pflanzenschutz ist Wissen um die molekularen Abläufe in verschiedenen Pilz-Pflanze-Interaktionen hilfreich. Dabei wird unter anderem das RNAi-System verwendet.
Der Brandpilz Thecaphora thlaspeos kann Brassicaceaen wie Arabis alpina oder Arabis hirsuta sowie unter Laborbedingungen Arabidopsis thaliana infizieren und bietet daher interessante Forschungsoptionen. Für diese zukünftige molekulare Erforschung wurden hier Methoden zur genetischen Modifikation von T. thlaspeos etabliert. Zudem wurde das RNAi-System dieses Pilzes auf Funktionalität und mögliche biologische Verwendung untersucht. Für die genetische Modifikation wurden aufgrund der Biologie von T. thlaspeos und erfolgreicher Methoden verwandter Pilze haploide Filamente aus Flüssigkultur für die Protoplasten-basierte Transformation gewählt. Hierfür konnten geeignete Zellwand-abbauende Enzyme, Puffer und Stabilisatoren identifiziert und zu einem effizienten Protokoll zur Gewinnung intakter Protoplasten optimiert werden. Basierend auf Parametern für zuverlässige Selektion für verschiedene Antibiotika konnten Resistenz-vermittelnde Plasmide hergestellt und erfolgreich in beide Stämme von T. thlaspeos transformiert werden. Analysen zeigten, dass beide Transformanten die Konstrukte langfristig stabil exprimieren. Die Analysen des RNAi-Systems ergaben, dass T. thlaspeos Gene für die Schlüsselkomponenten kodiert, die in Domänenarchitektur und Aminosäureidentität ihren Homologen aus verwandten Brandpilzen mit funktionellem RNAi-System ähneln. Als Alternative zur Deletion von Dicer wurden Methoden vorbereitet, die den Nachweis der Funktionalität entweder durch Expression von sRNA-Vorläufermolekülen von einem zweiten transformierten Konstrukt oder durch extern applizierte sRNAs ermöglichen sollten. Die Sequenzierung von sRNAs aus beiden Wildtypen zeigte, dass sRNAs meistens von rDNA-Loci stammen. Zudem weist die Akkumulation 22-24 nt langer sRNAs von Protein-kodierenden und intergenischen Regionen auf Dicer-abhängig generierte siRNAs und milRNAs und die Anhäufung von 30-32 nt langen sRNAs von prä-mRNA auf Dicer-unabhängig produzierte siRNAs hin. Vorhergesagte endogene Zieltranskripte der sRNAs legen nahe, dass T. thlaspeos sein RNAi-System zur Regulation des Zellzyklus und zur Kontrolle von Transposons nutzen könnte. Während der Infektion könnten durch pilzliche sRNAs pflanzliche Zieltranskripte mit Funktionen im Endomembrantransport mittels RNAi reguliert werden, wodurch das pflanzliche Immunsystem beispielsweise in der ROS-Bildung, Zellwandzusammensetzung oder Rezeptor-Recycling und -Faltung beeinträchtigt werden könnte. Durch RNAi-vermittelte Regulation weiterer putativer Zieltranskripte könnte indirekt die Synthese und Sekretion pflanzlicher sRNAs in extrazelluläre Vesikel reduziert werden, was wiederum die sRNA-induzierte Manipulation von der Pflanze im Pathogen reduzieren könnte. Auf diese Weise könnte das RNAi-System zum Infektionserfolg von T. thlaspeos beitragen.For targeted plant protection knowledge about the molecular processes in different fungus-plant interactions is helpful. For this the RNAi-system is utilized, among others. The smut fungus Thecaphora thlaspeos can infect Brassicaceae species such as Arabis alpina or Arabis hirsuta and, under laboratory conditions, Arabidopsis thaliana, which offers interesting research opportunities. For this future molecular research, methods to genetically modify T. thlaspeos were established here. Additionally, the fungal RNAi system was analyzed regarding functionality and possible biological utilization. For the genetic modification, haploid filaments from liquid culture were chosen for the protoplast-based transformation because of the fungal biology and successful methods used in related fungi. For this purpose, suitable cell wall degrading enzymes, buffers and stabilizers were identified and optimized to result in an efficient protocol for the isolation of intact protoplasts. Based on parameters for reliable selection for different antibiotics, resistance-mediating plasmids were produced and successfully transformed into both strains of T. thlaspeos. Analyses proved a stable and long-term expression of the constructs in both strains. The analysis of the RNAi system showed that T. thlaspeos encodes the genes for the key components which are similar in domain architecture and amino acid identity to their homologs in related smut fungi with a functional RNAi system. Alternatively to a Dicer deletion strain, methods were arranged that soon should prove the functionality by expression of precursor molecules from a second transformed construct or by external application of sRNAs. Sequencing of sRNAs from both wildtype strains showed that most sRNAs were derived from rDNA loci. Additionally, an accumulation of 22-24 nt sRNAs from protein-coding and intergenic regions suggests Dicer-dependently generated siRNA and milRNA and an enrichment of 30-32 nt sRNA from pre-mRNA hint at Dicer-independently generated siRNA. Predicted endogenous target transcripts of these sRNAs indicate T. thlaspeos could use its RNAi system to control its cell cycle and transposons. During the infection, fungal sRNAs could regulate plant target transcripts with roles in endomembrane transport via RNAi, so the plant immune system might get compromised in ROS generation, cell wall composition or receptor recycling and folding. RNAi-induced regulation of further putative target transcripts might indirectly reduce the synthesis and secretion of plant sRNAs in extracellular vesicles whereby the sRNA-mediated manipulation by the plant in the pathogen could be diminished. This way the RNAi system could contribute to the successful infection of T. thlaspeos. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 04.12.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 04.12.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 25.04.2024 | |||||||
| Datum der Promotion: | 29.10.2024 |
