Dokument: Immobilisierte Enzyme und Kofaktor-Regenerierung in der kontinuierlichen Durchflusssynthese

Titel:	Immobilisierte Enzyme und Kofaktor-Regenerierung in der kontinuierlichen Durchflusssynthese
Weiterer Titel:	Immobilized enzymes and cofactor regeneration in continuous flow synthesis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=67328
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20241112-105732-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Baumer, Benedikt [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 17,44 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.11.2024 / geändert 03.11.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Müller, Thomas J.J. [Gutachter]
Stichwörter:	Enzyme, Immobilisierung, Durchflusschemie, Flow Synthesis, Kofaktor, cofactor
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Um enzymkatalysierte Synthesen im Fluss nachhaltiger und effizienter zu gestalten, benötigt es eine Strategie zur Kofaktor-Regenerierung. Mithilfe dieser Strategie soll der Kofaktor Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) einerseits nur einmal dem System zugeben und andererseits lediglich substöchiometrisch eingesetzt werden müssen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein solches geschlossenes System mit Hilfe eines Phasenseparationssystems (FLLEX) entwickelt werden. Das bereits durch Döbber et al. bekannte System bestehend aus HaloTag™-LbADH und 2-Propanol als Kosubstrat diente hierbei als Startpunkt und konnte dahingehend erweitert werden, dass eine permanente Rückführung des Kofaktors und folglich der Einsatz von substöchiometrischen Mengen möglich war. Auf diese Weise konnten vier Ketone zu den entsprechenden Alkoholen mit Raum-Zeit-Ausbeuten bis zu 117 g L-1 h-1 und Gesamtumsatzzahlen für NADPH >12.000 mol/mol umgesetzt werden. Außerdem konnte ein Substratwechsel mit nur einer einzigen kofaktorhaltigen Lösung durchgeführt werden, was die Flexibilität des Systems hervorhebt. Die Implementierung des Systems in eine enzymatische Dominoreaktion mit der Lipase B aus Candida antarctica (CalB) konnte ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden. Dabei wurde die organische Phase nach Separation durch die FLLEX ohne zusätzliches Auffangen und Konzentrieren direkt weiterverarbeitet. Als wichtig stellte sich hier der Einsatz von Trockensäulen vor der CalB-Reaktion heraus, um vorhandene Feuchtigkeit aus dem System zu entfernen. Dennoch benötigte es zeitgleich einen großen Überschuss einer Acetylquelle, um vollständige Umsätze erzielen zu können. Besonders hervorzuheben ist zudem, dass in dem oben beschriebenen Modul catalytically active inclusion bodies, kurz CatIBs, zur Enzymimmobilisierung eingesetzt werden konnten. Die Alkoholdehydrogenase RADH, die eine komplementäre Enantioselektivität zur LbADH aufweist, wurde als Modellenzym verwendet. Die physikalische Fixierung der RADH-haltigen CatIBs in einer Kieselgel-Säule beseitigte anfängliches Auswaschen und auftretende Druckprobleme. Aufgrund der im Verhältnis zur LbADH geringen Aktivität wurde die RADH (in CatIBs) in einem Zwei-Enzym-System zusammen mit der HaloTag™-LbADH verwendet. Beide Enzyme lagen separiert voneinander vor, sodass die LbADH für die Kofaktor-Regenerierung zuständig war, während die RADH für die asymmetrische Reduktion von Ketonen eingesetzt wurde. In diesem komplexen System konnten entweder gute Umsätze oder gute Enantiomerenüberschüsse unter stöchiometrischem Einsatz des Kofaktors erzielt werden. Da die RADH (in CatIBs) eine geringe Aktivität mit 2-Propanol aufwies, wurde Cyclohexanol als alternatives Kosubstrat in dem etablierten geschlossenen Kofaktor-Regenerierungssystem verwendet. Unter diesen Bedingungen gelang es, mit dem oben erwähnten geschlossenen System über 120 h eine Raum-Zeit-Ausbeute von 3.6 g L-1 h-1 und eine Gesamtumsatzzahl für NADP(H) von 374 mol/mol zu erzielen. Besonders ist hier hervorzuheben, dass das System weitere 160 h mit Umsatzeinbußen auf 78 % stabil gefahren werden konnte. Abschließend konnte ebenfalls die Enreduktase YqjM mit HaloTag™-Immobilisierungsstrategie in der Durchflusssynthese eingesetzt werden. Zwei verschiedene Substrate wurden eingesetzt und diese konnten unter Verwendung stöchiometrischer Mengen an Kofaktor in guten bis sehr guten Umsätzen reduziert werden. Die Implementierung in das erwähnte Zwei-Enzym-System, um eine Kofaktor-Regenerierung zu ermöglichen, funktionierte in einer Machbarkeitsstudie, wobei gute Umsätze noch zu erzielen sind. In order to accomplish more sustainable and efficient enzyme-catalysed syntheses in flow set-ups, a strategy for cofactor regeneration is required. The strategy should cover the following: On the one hand the cofactor nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) must only be added once to the system, and on the other hand it can be used substoichiometrically. Within the scope of the present work, such a closed-loop system was developed through the support of a phase separation system (FLLEX). The system already known from Döbber et al. consisting of HaloTag™-LbADH and 2-propanol as cosubstrate served as starting point and could be developed into a continuous recycling of the cofactor allowing for the application of substoichiometric amounts. Hereafter, four ketones could be reduced to the corresponding alcohols with space-time yields of up to 117 g L-1 h-1 and total conversion numbers for NADPH >12,000 mol/mol. Moreover, a substrate switch was performed with only a single cofactor-containing solution, highlighting the flexibility of the system. Implementation of the established system in an enzymatic domino reaction with lipase B from Candida antarctica (CalB) was also successfully executed. Here, the organic output after the FLLEX-system was directly processed without additional capturing or concentrating. While the use of drying columns upstream of CalB proved important to remove any moisture from the system, a large excess of acetylation substrate was still necessary to achieve complete turnovers. It is particularly noteworthy, that in the above-described mode catalytically active inclusion bodies, or CatIBs, could be used as an alternative strategy for enzyme immobilization. Alcoholdehydrogenase RADH, which exhibits complementary enantioselectivity to LbADH, was used as model enzyme. Physical fixation of the CatIBs containing RADH in a column with silica gel eliminated initial washout and pressure problems. Because of their low activity relative to LbADH, RADH (in CatIBs) had to be used in a two-enzyme system together with HaloTag™-LbADH. Both enzymes were separated from each other physically allowing LbADH to be responsible for cofactor regeneration, while RADH was employed for the asymmetric reduction of ketones. In this complex system, either good conversions or good ee's could be obtained, while using the cofactor in stoichiometric amounts. Since RADH (in CatIBs) exhibited low activities with 2-propanol, cyclohexanol was used as alternative cosubstrate in the established closed-loop cofactor regeneration system. Under these conditions, a space-time yield of 3.6 g L-1 h-1 and a total turnover number for NADP(H) of 374 mol/mol were obtained over 120 h again using the formerly described closed system. It is particularly noteworthy that this system was able to run for an additional 160 h, with the conversion decreasing to 78%, only. In addition, the ene-reductase YqjM with a HaloTag™ immobilization strategy could be used in the simple flow-through synthesis. Two different substrates were employed, which could be reduced in good to very good conversions using stoichiometric amounts of cofactor. Implementation into the above mentioned two-enzyme system to enable cofactor regeneration did work as a proof of concept, while good conversions are still to be achieved.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Bioorganische Chemie
Dokument erstellt am:	12.11.2024
Dateien geändert am:	12.11.2024
Promotionsantrag am:	29.08.2023
Datum der Promotion:	19.02.2024