Dokument: Untersuchung der Signaltransduktion von Klasse II Zytokinrezeptoren unter Verwendung synthetischer Zytokinrezeptoren

Titel:	Untersuchung der Signaltransduktion von Klasse II Zytokinrezeptoren unter Verwendung synthetischer Zytokinrezeptoren
Weiterer Titel:	Investigation of signal transduction of class II cytokine receptors using synthetic cytokine receptors
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=67326
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250106-123438-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	De Vos, Frederik Henry [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.11.2024 / geändert 03.11.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Jürgen Scheller [Gutachter] Lang, Philipp [Gutachter]
Stichwörter:	Klasse II Zytokinrezeptoren, Typ I Interferone, synthetische Zytokinbiologie, SyCyR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Interferone sind, wie auch andere Zytokine, Proteine mit pleiotropen Effekten. Die in dieser Arbeit anhand von Interferon α4 analysierten Typ I Interferone nehmen dabei eine ambivalente Rolle ein. So sind sie essenziell an der Steuerung der Immunantwort beteiligt und treten dabei als ausschlaggebend in der körpereigenen Bekämpfung von viralen Infektionen und neoplastischen Erkrankungen auf. Andererseits gibt es eine Korrelation zwischen einer Überaktivität von Interferonen und autoimmunen Geschehen. Auch können chronisch niedrige Interferonspiegel das Immunsystem in seiner Funktion hindern. Angesichts der bislang limitierten Therapiemöglichkeiten auf diesen Gebieten, ist diese Zytokinklasse von großem Interesse für die Forschung. Ein Problem bei der therapeutischen Anwendbarkeit von Interferonen ist die mangelnde Steuerbarkeit der Signalantwort. Dies wird durch die besagten ambivalenten Effekte deutlich. Ziel dieser Arbeit war es, ein hintergrundfreies, steuerbares System zu erzeugen und zu analysieren, ob Signaltransduktion und Genexpression des synthetischen Systems dem natürlichen Rezeptor entsprechen. Es erfolgte die Konstruktion eines synthetischen Zytokin/Zytokinrezeptorsystems, bei dem die extrazelluären Domänen der beiden Untereinheiten des Interferon-α/β-Rezeptors (IFNAR), IFNAR1 und IFNAR2, jeweils gegen nanobodies (Einzeldomänenantikörper) ausgetauscht wurden. Diese erkannten die fluoreszierenden Proteine GFP (green fluorescent protein) und mCherry, welche als synthetische Liganden dienten und als heterodimere Fusionsproteine die Rezeptordimerisierung einleiteten. Die transmembranäre und intrazelluläre Domäne wurden beibehalten, damit die ursprüngliche Signaltransduktion, die hauptsächlich über den JAK-STAT-Weg vermittelt wird, stattfinden konnte. Zu Anfang wurde die cDNA für den synthetischen und den natürlichen Rezeptor in verschiedene Expressionsvektoren kloniert. Die Steuerbarkeit des synthetischen Rezeptors wurde anhand von Stimulationen in verschiedenen Zelllinien geprüft. Auch wurde die Signaltransduktion der Rezeptoren untereinander verglichen. Dazu wurden in verschiedenen Zelllinien vor allem Proteine des JAK-STAT-Weges mittels Western Blot nachgewiesen, anhand eines microarray das entsprechende Transkriptom näher analysiert, die Genexpression mittels real-time qPCR beobachtet und auch die Effekte auf die Zellproliferation verglichen. Die Ergebnisse führten zu dem Schluss, dass die synthetischen Zytokinrezeptoren die natürlichen Rezeptoren in ihrer Signaltransduktion imitieren. Als Teil des rasant an Bedeutung gewinnenden Feldes der synthetischen Zytokinbiologie, sind diese eigens konstruierten Systeme, aufgrund Ihrer Hintergrundfreiheit und Steuerbarkeit, ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung entsprechender zellulärer Mechanismen und bieten damit neue Möglichkeiten in der Therapie verschiedenster Erkrankungen. Like other cytokines, interferons are proteins with pleiotropic effects. Type I interferons which were analyzed in this study on the basis of interferon α4, play an ambivalent role. On the one hand they are essential in controlling the immune response and crucial in the body's fight against viral infections and neoplastic diseases. On the other hand there is a correlation between overactivity of interferons and autoimmune diseases. Furthermore, chronically low levels of interferon can hinder the immune system in its function. In the view of limited therapeutic options in these areas this cytokine class is of great interest for current research. A major problem concerning therapeutical applicability of interferons are difficulties in controlling the signal response. This becomes clear with regard to the mentioned ambivalent effects. The goal of this work was to construct a background-free controllable system and to analyze whether signal transduction and gene expression correspond to the natural receptor. Therefore, a synthetic cytokine/cytokine receptor system was constructed, whereby the extracellular domains of both interferon α/β receptors (IFNAR), IFNAR1 and IFNAR2, were switched with nanobodies (single-domain antibodies). These antibodies recognized the fluorescent proteins GFP (green fluorescent protein) and mCherry, which served as synthetic ligands and composed as heterodimeric fusion proteins lead to receptor dimerization. The transmembrane and intracellular domains were kept, so the original signal transduction, mediated predominantly via the JAK-STAT pathway, was not altered. Initially, the cDNA for the synthetic and natural receptor was cloned into different expression vectors. The controllability of the synthetic receptor was analyzed by stimulation of various cell lines. Additionally, signal transduction of both receptor variants was compared to one another. Therefore, proteins of the JAK-STAT pathway were detected in different cell lines via Western blotting, the resulting transcriptome was determined by microarray, gene expression was illustrated using real-time qPCR and effects on cell proliferation were compared. The results led to the conclusion that the synthetic receptors are able to imitate the natural signal transduction. As a part of the rapidly growing field of synthetic biology, these particularly designed systems with regard to their background-free and controllable features are valuable tools for further exploration of cellular mechanisms and therapy of various kinds of diseases.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Bezug:	2019-2024/25
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II
Dokument erstellt am:	06.01.2025
Dateien geändert am:	06.01.2025
Promotionsantrag am:	06.06.2024
Datum der Promotion:	29.10.2024