Dokument: Einfluss des NAD(H)-Pools auf die Produktivität bei Ganzzellbiotransformationen
| Titel: | Einfluss des NAD(H)-Pools auf die Produktivität bei Ganzzellbiotransformationen | |||||||
| Weiterer Titel: | Influence of the NAD(H) pool on the productivity of whole cell biotransformations | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6723 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20080122-104034-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Heuser, Florian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | NAD(H)-Pool, Ganzzellbiotransformation | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Ziel dieser Arbeit war es, den intrazellulären NAD-Turnover zu begrenzen und die intrazelluläre NAD-Konzentration in Escherichia coli zu erhöhen, um einen Stamm zu konstruieren, der sich durch eine höhere Produktivität und eine bessere Langzeitstabilität in der reduktiven Ganzzellbiotransformation auszeichnete. Hierzu wurden zunächst die Gene yrfE und yjaD deletiert, die für NADH-Pyrophosphatasen kodieren, welche vermutlich eine Rolle im intrazellulären NAD-Abbau spielen. Nach Deletion dieser Gene war die spezifische Aktivität der NADH-Pyrophosphatase im Rohextrakt um 70 % reduziert. Durch die Überexpression der Gene pncB und nadE aus der NAD-Biosynthese konnte eine Verdopplung der intrazellulären NAD-Konzentration erreicht werden. Die gemeinsame Überexpression beider Gene erhöhte den NAD-Pool um den Faktor sieben.
Ein rekombinanter Stamm von E. coli zur Gewinnung von D-Mannitol aus D-Fruktose war Bezugssystem zur Untersuchung, ob die Mutationen im NAD-Metabolismus einen Einfluss auf die Langzeitstabilität von Ganzzellbiotransformationen haben. D-Fruktose wurde hier mittels einer Mannitol-Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides zu D-Mannitol reduziert. Der Kofaktor NADH wurde mittels einer Formiat-Dehydrogenase aus Mycobacterium vaccae N10 regeneriert. Die Aufnahme von D-Fruktose wurde durch einen Glukosefacilitator aus Zymomonas mobilis ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde festgestellt, dass die Zellen während der Biotransformation NAD(H) über eine permeabilisierte Zellmembran verloren. Als Ursache für die Zellpermeabilisierung wurde eine Akkumulation von D-Mannitol in der Zelle ermittelt, was zum Platzen der Zellen durch den erhöhten osmotischen Druck führte. Durch die Klonierung eines putativen Mannitoltransportergens aus L. pseudomesenteroides konnte die Langzeitstabilität des rekombinaten E. coli erhöht werden, so dass die Mannitolausbeute nach drei Tagen Biotransformation um 20 % gesteigert werden konnte.Abstract The aim of this work was to limit the intracellular NAD turnover and to increase the intracellular NAD concentration in Escherichia coli in order to construct a strain characterized by higher productivity and improved long-term stability in the reductive whole-cell biotransformation. To this end, first the genes yrfE and yjaD were deleted, which code for the NADH-pyrophosphatases that probably play a part in intracellular NAD degradation. After deletion of these genes, the specific activity of the NADH-pyrophosphatase in the raw extract was reduced by 70 %. By overexpressing the genes pncB and nadE from the NAD biosynthesis it was possible to double the intracellular NAD concentration. The joint overexpression of the two genes increased the NAD pool by a factor of seven. A recombinant strain of E. coli for obtaining D-mannitol from D-fructose was the reference system for studying whether the mutations in the NAD metabolism influenced the long-term stability of whole-cell transformations. Here, D-fructose was reduced to D-mannitol by a mannitol dehydrogenase from Leuconostoc pseudomesenteroides. The cofactor NADH was regenerated by a formate dehydrogenase from Mycobacterium vaccae N10. The uptake of D-fructose was made possible by a glucose facilitator from Zymomonas mobilis. In the present study, it was found that during the biotransformation the cells lost NAD(H) via a permeabilized cell membrane. The cause of cell permeabilization was found to be an accumulation of D-mannitol in the cell, which led to bursting of the cell due to increased osmotic pressure. By cloning a putative mannitol transport gene from L. pseudomesenteroides, it was possible to increase the long-term stability of the recombinant E. coli, so that after three days of biotransformation the mannitol yield was increased by 20 %. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 25.01.2008 | |||||||
| Dateien geändert am: | 25.01.2008 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 16.08.2007 | |||||||
| Datum der Promotion: | 09.11.2007 |
