Dokument: Alternativ gespleißter humaner Tissue Factor: Klonierung, Expression und Untersuchung der prokoagulatorischen Aktivität
| Titel: | Alternativ gespleißter humaner Tissue Factor: Klonierung, Expression und Untersuchung der prokoagulatorischen Aktivität | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6721 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20080115-112406-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dipl.-Biol. Bobbe, Anett [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Schrör, Karsten [Gutachter] Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Der humane tissue factor (HTF) ist der Initiator der Blutgerinnung. Er wird konstitutiv in Organen (z. B. Herz, Hirn, Haut) und der Blutgefäßwand (glatte Gefäßmuskelzellen, Fibroblasten) exprimiert. Geringe TF-Mengen sind im Blut gesunder Probanden nachweisbar, welche in verschiedenen pathologischen Zuständen (z. B. akutes Koronarsyndrom) ansteigen und oft mit einer Steigerung des prothrombotischen Status einhergehen. Im Jahr 2003 wurde eine alternativ gespleißte TF-Form (asHTF) entdeckt, welche löslich ist und deren Aktivität kontrovers diskutiert wird.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden HTF und asHTF erstmals aus venösen glatten Muskelzellen kloniert, heterolog in HEK293-Zellen exprimiert und vergleichend charakterisiert. HTF ist membranär lokalisiert und ließ sich erwartungsgemäß in Zelllysat und Mikropartikeln, nicht aber im mikropartikelfreien Überstand nachweisen. Im Gegensatz dazu fand sich asHTF nur im Zelllysat, was auf eine rein intrazelluläre Lokalisation schließen lässt. Beide Proteine wiesen Glykosylierungen auf, welche sich enzymatisch entfernen ließen. Zwei verschiedene Aktivitätstests (ETP-Test, FX-Aktivierung) wurden für die Bestimmung der prokoagulatorischen Aktivität von HTF und asHTF eingesetzt. HTF zeigte in den entsprechenden Zellfraktionen (intakte Zellen, Zelllysat, Mikropartikel) eine glykosylierungsunabhängige prokoagulatorische Aktivität, welche sich signifikant von den Aktivitäten der Kontrollen unterschied. Für asHTF ließ sich ebenfalls unabhängig vom Glykosylierungsstatus selbst unter Verwendung unverdünnten Zelllysats keine prokoagulatorische Aktivität detektieren. Eine Kompetition von asHTF mit rekombinanten HTF um Gerinnungsfaktoren konnte nicht nachgewiesen werden. Eine antikoagulatorische Wirkung durch Konkurrenz um Gerinnungsfaktoren kann somit ausgeschossen werden. Bei asHTF handelt es sich um ein neues interessantes Protein, welches sich vom Initiator der Blutgerinnung ableitet jedoch selbst nicht prokoagulatorisch aktiv ist. Ob asHTF eventuell zur Signaltransduktion fähig ist oder wie seine Kristallstruktur aussieht, gehört zu den Fragestellungen, welche noch zu untersuchen sind.The human tissue factor (HTF) is the initiator of blood coagulation. It is constitutively expressed in organs (e. g. heart, brain, skin) and on cells of the vascular wall (smooth muscle cells, fibroblasts). Low levels of HTF are also detected in the blood of healthy volunteers. Pathological conditions (e. g. acute coronary syndrome) are frequently associated with an increase in TF protein and an enhanced prothrombotic potential. In 2003 an alternatively spliced soluble form of human tissue factor (asHTF) was discovered, the pro-coagulant activity of which is controversially discussed. The work described here reports for the first time the cloning of both HTF and asHTF from vascular smooth muscle cells. Both proteins were overexpressed in HEK239 cells and characterized in parallel. HTF is located within the cell membrane and could therefore be detected in cell lysate and microparticles but not in microparticle-free supernatant. AsHTF by contrast was found exclusively in cell lysate. This fact suggests that asHTF exhibits intracellular localization only. Glycosylation of HTF and asHTF was demonstrated by a shift to smaller protein bands after incubation with glucosidase. Two different activity assays (ETP-test, FX-activation) were used to determine the pro-coagulant activity of HTF and asHTF. Only membrane-containing cell fractions of HTF-expressing cells (whole cells, cell lysate, microparticles) exhibited significantly higher pro-coagulant activities than controls, which was independent of its glycosylation status. No procoagulant activity of asHTF could be detected, even in undiluted cell lysates and irrespective of glycosylation status. No competition between asHTF and rHTF for binding to clotting factors was observed, thus asHTF cannot exert anti coagulatory effects. In conclusion, the newly describe protein asHTF derives from the initiator of blood coagulation (tissue factor) but does not exhibit pro-coagulant activity. The crystal structure of asHTF or its potential to elicit cellular signaling are questions to be explored in future studies. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Pharmakologie und Klinische Pharmakologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 24.01.2008 | |||||||
| Dateien geändert am: | 24.01.2008 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 04.12.2007 | |||||||
| Datum der Promotion: | 10.01.2008 |
