Dokument: Lead Optimization of an N-type Calcium Channel Blocker for a General Neuroprotection Approach

Titel:	Lead Optimization of an N-type Calcium Channel Blocker for a General Neuroprotection Approach
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=67072
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20241021-085420-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wollert, Esther Katharina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 16,01 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.10.2024 / geändert 16.10.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Masters, Colin L. [Gutachter]
Stichwörter:	Neurodegenerative diseases, Alzheimer's disease, Ca2+, Voltage-Gated Calcium Channels (VGCCs), N-type VGCC (CaV2.2), D-enantiomeric peptides
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ca2+ Ionen stellen einen der wichtigsten Botenstoffe im Körper dar und spielen eine zentrale Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, vor allem in erregbaren Zellen wie Neuronen. Dies bedingt die Notwendigkeit einer entsprechend strikten Kontrolle der homöostatischen Prozesse als Grundlage für die normale physiologische Funktion aller Zellen. Ein zentraler Kontrollmechanismus ist der kontrollierte Ca2+ Einstrom in die Zelle, der zu einem Großteil durch spannungsgesteuerte Ca2+ Kanäle (VGCCs) reguliert wird, die einen Ca2+ Einstrom als Folge einer Membran-Depolarisation bedingen. Es wurde bereits mehrfach nachgewiesen, dass abweichende zytosolische Ca2+ Konzentrationen eine kausale Rolle in einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen spielen, indem durch toxische Übererregung der Neuronen final der neuronale Zelltod verursacht wird. In diesem Kontext war eines der Ziele dieser Arbeit neue interessante zentrale krankheitsassoziierte Proteine zu identifizieren, die potentiell toxische Ca2+ Ströme vermitteln. Durch semi-quantitative Analyse der Proteinkonzentration von VGCCs in verschiedenen Hirnarealen eines Mausmodells der Alzheimer Demenz (AD) konnten wir den VGCC des N-Typs (CaV2.2) identifizieren, der eine progressive Überexpression im Krankheitsverlauf zeigte. Für das D-enantiomere Peptid RD2 konnte in vorangegangenen Studien bereits eine inhibitorische Wirkung auf CaV2.2-vermittelte Ca2+ Ströme gezeigt werden, weshalb RD2 als vielversprechende Leitstruktur für die Behandlung von vermeintlich CaV2.2-bedingter Neurodegeneration gewählt wurde. Eines der Hauptziele dieser Arbeit war die Analyse der Interaktion von RD2 mit CaV2.2 Kanälen, um auf Basis hiervon nachfolgend die Leitstruktur im Hinblick auf Effizienz und Spezifität ihrer inhibitorischen Wirkung auf CaV2.2 Kanäle zu optimieren. In Übereinstimmung mit dem zuvor erbrachten in vitro Nachweis der inhibitorischen Wirkung von RD2 auf durch CaV2.2 vermittelte Ca2+ Ströme konnten wir diese Wirkung in in vivo Experimenten mit Ca2+ Bildgebungsverfahren in wachen Mäusen weiter bestätigen. Wir konnten hierbei zeigen, dass RD2 nicht nur die Signalübertragung von der Peripherie zum Gehirn geringfügig hemmt, sondern auch die intrakortikale Kommunikation beeinflusst, die vermeintlich an der Signalverarbeitung beteiligt ist. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Studie war die funktionelle Expression und Reinigung des Kanals in seiner nativen, dreidimensionalen Konformation als Basis für nachfolgende Bindungstests zur Optimierung der Leitstruktur. Hierfür konnte ein Protokoll entwickelt werden, das eine partielle Reinigung des CaV2.2 Proteins aus komplexem Zelllysat ermöglicht. Dies stellte die Basis für Analysen der Bindungskinetik von RD2 in Komplex mit CaV2.2 dar, in denen eine starke Assoziation mit einem entsprechenden Dissoziationskoeffizienten im niedrigen nanomolaren Bereich gezeigt werden konnte. Mit Hilfe von rationalem Design wurde ein erster, von der Leitstruktur RD2 abgeleiteter Kandidat, namentlich RD2C, entwickelt, der eine verbesserte inhibitorische Wirkung auf CaV2.2-vermittelte Ca2+ Ströme zeigte. Es konnte beobachtet werden, dass RD2C CaV2.2-vermittelte Ca2+ Ströme deutlich stärker als RD2 hemmt, dabei jedoch ähnlich dosisabhängig und vollständig reversibel wirkt. Weitergehend haben wir Peptid-Rezeptor-Docking-Modellierung verwendet, um die zugrunde liegende Wirkungsweise der Hemmung von CaV2.2 durch RD2 oder RD2C genauer zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten auf einen flexiblen Bindungsmodus von RD2 und RD2C an CaV2.2 Kanälen hin, der innerhalb der elektronegativen Tasche lokalisiert ist, die den Eingang der Ca2+-permeablen Pore bildet. Zudem konnte festgestellt werden, dass diese Interaktion hauptsächlich durch elektrostatische Wechselwirkungen stabilisiert wird. Diese Ergebnisse deuten auf einen Porenblockierungsmechanismus von RD2 und RD2C hin, der hauptsächlich durch die positive Gesamtladung und den Arginin-reichen C-Terminus vermittelt wird. Die hier gewonnenen Erkenntnisse bilden eine interessante Grundlage für die laufende Optimierung von CaV2.2-hemmenden D-enantiomeren Peptiden mittels rationalen Designs. Insgesamt konnte in dieser Arbeit der CaV2.2 Kanal als potenzielles neues therapeutisches Ziel für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen identifiziert werden, wofür zusätzlich ein entsprechendes D-Peptid als Leitstruktur für die anschließende Hemmung dieser Kanäle charakterisiert und erste erfolgreiche Optimierungsprozesse durchgeführt wurden. Calcium (Ca2+) signaling plays a central role in numerous cellular processes, especially in excitatory cells, such as neurons, creating the necessity for tight regulation and homeostasis to facilitate normal cellular function. In part, this neuronal Ca2+ influx is mediated by ion channels from the family of Voltage-Gated Calcium Channels (VGCCs), which regulate Ca2+ transmembrane fluxes into the cell in response to membrane depolarization. Previously, it was shown that cytosolic Ca2+ levels are affected in numerous neurodegenerative diseases, subsequently followed by excitotoxicity-induced neurodegeneration. In this context, we aimed to identify putative key proteins mediating excitotoxic Ca2+ fluxes and found the N-type VGCC (CaV2.2) as promising target, as we could show a disease progression-associated upregulation of the protein in a mouse model of Alzheimer’s disease (AD). We were previously able to show the inhibitory capacity of the all D-enantiomeric peptide RD2 on CaV2.2 channels, making RD2 a promising lead candidate for the treatment of putative CaV2.2-mediated neurodegeneration for a general neuroprotection approach. One central aim of this study was to understand the interaction of RD2 with CaV2.2 channels more in detail to subsequently improve the lead candidate with regard to its inhibitory capacity and specificity. In addition to previously obtained in vitro proof of concept of the inhibitory capacity of RD2 on Ca2+ fluxes mediated by CaV2.2, we were able to further confirm this effect in in vivo experiments using a wide-field Ca2+ imaging-based approach in awake mice. We could show that RD2 not only inhibits signal transmission from the periphery to the brain, but was further observed to influence intracortical signaling, which is thought to be involved in signal processing. Another objective of this study was to functionally express and purify the channel in its native three-dimensional conformation as basis for subsequent binding assays for the optimization of the lead compound. A first protocol was developed, that achieved partial separation of CaV2.2 protein from complex cell lysates. This paved the way for the analysis of binding kinetics of RD2 in complex with CaV2.2, showing an overall strong association with a respective dissociation coefficient in the low nanomolar range. Using rational design, a first lead-derived candidate, namely RD2C, was identified that demonstrates improved inhibitory effects on CaV2.2 currents. RD2C was able to inhibit CaV2.2-mediated currents significantly stronger than RD2, while showing a similar dose-dependent and fully reversible inhibition manner. In addition, we used peptide docking modeling to assess the underlying mode of action of the inhibition of CaV2.2 by RD2 or RD2C more in detail. Results suggested a flexible binding mode of RD2 and RD2C on CaV2.2 channels inside the electronegative cavity associated with the Ca2+-permeable pore, which was mainly mediated through electrostatic interactions. These results point towards a pore-blocking mechanism of RD2 and RD2-derived D-peptides, mainly mediated through their overall positive net charge and the arginine-rich C-terminal region. Here obtained findings will subsequently provide an interesting basis for the ongoing optimization of CaV2.2-inhibiting D-peptides using rational design. Taken together, in this study we present the CaV2.2 as a potential new therapeutic target for the treatment of neurodegenerative diseases in a general neuroprotective approach, and a corresponding D-peptide as lead compound for subsequent inhibition.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	21.10.2024
Dateien geändert am:	21.10.2024
Promotionsantrag am:	13.06.2024
Datum der Promotion:	27.08.2024