Dokument: Artificial ligands and biological interactors of GABARAP: Insights from a structural, biophysical, and imaging perspective

Titel:	Artificial ligands and biological interactors of GABARAP: Insights from a structural, biophysical, and imaging perspective
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=66752
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240911-111917-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Üffing, Alina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 47,03 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.09.2024 / geändert 10.09.2024
Beitragende:	Prof.Dr. Willbold Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Reichert, Andreas [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The γ-aminobutyric acid type A receptor-associated protein (GABARAP) is one out of seven human autophagy related 8 (ATG8) proteins, which can be divided into the GABARAP and microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3/LC3) subfamilies. The seven paralogs show high structural similarity and all consist of a ubiquitin-like fold with two additional, less conserved N-terminal α-helices, which participate in protein-protein and protein-lipid interactions. Furthermore, the ATG8 proteins can be covalently conjugated to membranes by an E1-E2-E3-like enzyme cascade after exposure of a C-terminal glycine. Many interaction partners bind to the two hydrophobic pockets (HP1 and HP2) on the surface of the ATG8s via a moderately conserved so-called LC3-interacting region (LIR), supporting a wide range of affinities. This explains, at least partially, how the paralogs fulfill their non-redundant functions in autophagy-related and -unrelated processes, and can be exploited to develop selective binders for the two subfamilies or even for individual members. In this work, interactions of GABARAP were studied from different perspectives: First, from a structural perspective by investigating artificial ligands of ATG8s, namely stapled (i.e., internally crosslinked) peptides including Pen3-ortho and Pen8-ortho. These peptides, which only differ in the position of two methyl groups, bind GABARAP and LC3B with different selectivity, with Pen3-ortho preferring GABARAP 100-fold over LC3B, while Pen8-ortho binds both paralogs with similar affinities. The X-ray structures of the two stapled peptides in complex with GABARAP revealed different binding modes—one resembling the orientation of natural ligands and the other showing antiparallel orientation relative to the β2-strand of GABARAP. Additionally, the small-molecule compound GW5074 was analyzed regarding its interaction with GABARAP. Chemical shift perturbation determined by a heteronuclear single quantum coherence (HSQC) nuclear magnetic resonance (NMR) titration of 15N GABARAP with GW5074 revealed engagement of HP1, complementing data on the structure-activity relationships of arylidene-indolinone ligands of GABARAP and LC3B. Concurrently, the epidermal growth factor receptor (EGFR) was investigated as a putative direct biological interactor of GABARAP from both a structural and a biophysical perspective. Preceding this work, enhanced degradation of the EGFR after EGF stimulation had been reported for cells lacking GABARAP, but not its paralogs. In-vitro affinity measurements with an EGFR-derived LIR peptide revealed selectivity for GABARAP and its closest paralog GABARAPL1. Additionally, the X-ray structure of a chimeric protein generated by fusion of the putative EGFR LIR with GABARAP revealed canonical binding to HP1 and HP2 of GABARAP. HSQC NMR titrations of the putative EGFR LIR peptide and GABARAP further supported this notion, offering a potential explanation for the reported phenotype. Finally, a bivalent GABARAP-mTagBFP2-GABARAP construct was applied to study putative interactions from a live-cell imaging perspective. Interestingly, the construct strongly highlighted microtubules, which have been reported to interact with GABARAP in early in-vitro studies. Positively charged residues in the N terminal region of GABARAP suggested to be responsible in these studies proved to be crucial for the peculiar localization of the bivalent construct in living cells. Additionally, microtubule association was dependent on the choice of mTagBFP2 as a fluorophore. In conclusion, this work provides insights from different perspectives that enhance our understanding of the multifaceted human ATG8 protein family—with a focus on GABARAP. The findings reported herein can be applied in future research to further investigate biological processes involving these proteins and to develop powerful modulators for application in cell biology and medicine. Das γ-aminobutyric acid type A receptor-associated protein (GABARAP) ist eines von sieben humanen Autophagie assoziierten (ATG8) Proteinen, welche sich in die GABARAP und microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3/LC3) Unterfamilien unterteilen lassen. Die sieben Paraloge weisen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit auf und besitzen eine ubiquitinähnliche Faltung mit zwei zusätzlichen, weniger konservierten N-terminalen α-Helices, welche an Protein-Protein und Protein-Lipid Interaktionen beteiligt sind. Des Weiteren können die ATG8 Proteine nach Freilegung eines C-terminalen Glycins durch eine E1-E2-E3-ähnlichen Enzymkaskade kovalent an Membranen konjugiert werden. Viele Interaktionspartner binden an zwei hydrophobe Taschen (HP1 und HP2) auf der Oberfläche der ATG8 mithilfe einer moderat konservierten LC3-interagierenden Region (LIR), die ein breites Spektrum an Affinitäten abdeckt. Dies erklärt zumindest teilweise, wie die Paraloge ihre nicht-redundanten Funktionen in autophagischen und nicht-autophagischen Prozessen erfüllen und kann für die Entwicklung selektiver Bindungspartner für die zwei Unterfamilien oder sogar individuelle Mitglieder der ATG8s genutzt werden In dieser Arbeit wurden Interaktionen von GABARAP aus verschiedenen Perspektiven untersucht: Erstens aus einer strukturellen Perspektive durch die Untersuchung artifizieller Liganden, genauer stapled (d.h. intern vernetzten) Peptiden, unter anderem Pen3-ortho and Pen8-ortho. Diese Peptide, welche sich nur in der Position zweier Methylgruppen unterscheiden, binden GABARAP und LC3B mit verschiedenen Selektivitäten, wobei Pen3-ortho GABARAP 100-fach gegenüber LC3B präferiert, während Pen8-ortho beide Paraloge mit vergleichbarer Affinität bindet. Die Röntgenkristallstruktur der beiden stapled Peptide in einem Komplex mit GABARAP zeigte verschiedene Bindungsmodi — einer ähnelt der Ausrichtung natürlicher Liganden, der andere zeigt eine antiparallele Ausrichtung zu GABARAPs β2-Strang. Außerdem wurde das small-molecule compound GW5074 in Bezug auf seine Interaktion mit GABARAP untersucht. Die Änderung der chemischen Verschiebung, welche mittels heteronuclear single quantum coherence (HSQC) NMR Titration von 15N GABARAP mit GW5074 bestimmt wurde, zeigte die Einbindung der HP1. Dies ergänzt Daten zur Struktur-Aktivität Beziehung von Aryliden-Indolinon-Liganden mit GABARAP und LC3B. Gleichzeitig wurde der epidermal growth factor receptor (EGFR) als möglicher direkter biologischer Interaktionspartner von GABARAP, sowohl aus struktureller als auch aus biophysikalischer Sicht untersucht. Im Vorhinein dieser Arbeit wurde ein verstärkter Abbau von EGFR nach EGF-Stimulation, spezifisch in GABARAP-defizienten, aber nicht Paralog-defizienten Zellen berichtet. In-vitro Affinitätsmessungen mit einem EGFR abgeleiteten LIR-Peptid zeigten eine Selektivität für GABARAP und sein nächstes Paralog GABARAPL1. Darüber hinaus ergab die Röntgenkristallstruktur eines chimären Proteins, welches als Fusion des mutmaßlichen EGFR-LIR Peptids mit GABARAP generiert wurde, eine kanonische Bindung an GABARAPs HP1 und HP2. HSQC NMR Titration des mutmaßlichen EGFR-LIR-Peptids zu GABARAP unterstützten diese Beobachtung und bieten eine mögliche Erklärung für den beschriebenen Phänotyp. Zuletzt wurde ein bivalentes GABARAP-mTagBFP2-GABARAP zur Untersuchung möglicher Interaktionen aus einer Lebendzellmikroskopie Perspektive angewendet. Interessanterweise hob das Konstrukt Mikrotubuli stark hervor, von denen in frühen in-vitro-Studien berichtet wurde, dass sie mit GABARAP interagieren. Positiv geladene Seitenketten in der N-terminalen Region von GABARAP, welche in diesen Studien für die Assoziation mit Mikrotubuli verantwortlich gemacht wurden, erwiesen sich entscheidend für die besondere Lokalisierung des bivalenten Konstrukts in Zellen. Darüber hinaus war die Mikrotubuli Assoziation abhängig vom Fluorophor, im speziellen mTagBFP2. Zusammenfassend bietet diese Arbeit Einsichten aus verschiedenen Perspektiven, welche unser Verständnis der vielen Facetten humaner ATG8 Proteine erweitern — mit besonderem Fokus auf GABARAP. Die hier erlangten Erkenntnisse können in Zukunft genutzt werden, um biologische Prozesse, an denen diese Proteine beteiligt sind, weiter zu untersuchen und wirksame Modulatoren für die Anwendungen in der Zellbiologie und Medizin zu entwickeln.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	11.09.2024
Dateien geändert am:	11.09.2024
Promotionsantrag am:	17.07.2024
Datum der Promotion:	27.08.2024