Dokument: Exploiting protein self-interactions for inhibition of specific steps in amyloid formation

Titel:	Exploiting protein self-interactions for inhibition of specific steps in amyloid formation
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=66588
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20251002-084028-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schulz, Celina Michelle [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 219,78 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.08.2024 / geändert 21.08.2024
Beitragende:	Dr. Hoyer, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke Holger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Weltweit sind zahlreiche Patienten von Proteinfehlfaltungskrankheiten betroffen, die durch die Bildung von unlöslichen Amyloidfibrillen verursacht werden, welche sich als Proteinablagerungen ansammeln können. Amyloidfibrillen stellen hoch geordnete, unlösliche Proteinaggregate mit einer charakteristischen Cross-β Konformation dar. Verschiedene Sequenzen können trotz ihrer Unterschiede diese Konformation annehmen und aggregieren, ein Phänomen, das häufig bei Amyloid-Krankheiten, wie Alzheimer oder Parkinson, beobachtet wird. Diese Arbeit befasst sich mit zwei Hauptthemen, der Untersuchung der mechanistischen Rolle der intrinsisch ungeordneten Regionen bei der Amyloidbildung von α-Synuclein (αS) und dessen Hemmung, sowie der Erforschung der pathophysiologischen Auswirkungen auf Zellen, die durch verschiedene Aggregationsarten hervorgerufen werden. Im ersten Teil wurden die Wirkungsweisen von Amyloid Inhibitoren untersucht. Inhibitoren der Amyloidbildung können an verschiedenen Stellen ansetzen, z. B. an den Fibrillenenden, um das Fibrillenwachstum zu verhindern. Bisher zeigte das gentechnisch hergestellte Protein WT-CC48, eine Fusion von Wildtyp (WT) αS mit der disulfidhaltigen αS Mutante CC48, ein hohes Potenzial zur Hemmung des Fibrillenwachstums. Hier haben wir untersucht, welche Regionen von WT-CC48 für die stark hemmende Wirkung verantwortlich sind, indem wir eine Reihe von verkürzten Versionen von WT-CC48 charakterisiert haben. Wir zeigen, dass sowohl im WT- als auch im CC48-Teil des Fusionskonstrukts die Segmente, die den β-Faltblattkern der αS Fibrillen bilden, für die starke Hemmung erforderlich sind. Dies deutet darauf hin, dass die Abdeckung der gesamten Schnittstelle des β-Faltblattkerns, die am Fibrillenende exponiert ist, für die Optimierung von Fibrillenverlängerungsinhibitoren von Vorteil ist. Überraschenderweise kann sogar ein αS-Monomer Bindungsprotein eine substöchiometrische Hemmung der αS-Aggregation erreichen. Das gentechnisch hergestellte Bindungsprotein β-wrapin AS69 komplexiert monomeres αS im Bereich der Aminosäuren 30-60, während die restliche Sequenz in der intrinsisch ungeordneten Struktur verbleibt. Wir konnten zeigen, dass diese substöchiometrische Aktivität nicht nur den globulären Teil des Komplexes, sondern auch die ungeordneten Proteinregionen von αS erfordern. Dies bedeutet, dass die Fähigkeit von ungeordneten Proteinregionen, die Amyloidbildung zu stören, von Hemmstoffen ausgenutzt werden kann, um spezifische Mechanismen in vitro und in zellulären Aggregationsexperimenten zu inhibieren. Auf dieser Grundlage wurde ein Inhibitor mit dem Namen AS69nuc entwickelt, der spezifisch die Nukleation von αS Fibrillen, nicht aber deren Wachstum hemmt. Durch die Verwendung von AS69nuc als künstliches Werkzeug konnten wertvolle Einblicke in die Aggregationsvermehrung im diagnostischen Amplifikationstest (SAA) gewonnen werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass unter SAA-Bedingungen die sekundäre Nukleation die Proliferation antreibt, die durch die Zerebrospinalflüssigkeit von Parkinson-Patienten initiiert wird. Der zweite Teil konzentriert sich auf das Verständnis der Mechanismen der zellulären Internalisierung und der pathophysiologischen Auswirkungen von Fibrillen und oligomeren Formen. Die Sequenzierung der nächsten Generation (Next Generation Sequencing) wurde durchgeführt, um Einblicke in die zellulären Reaktionssysteme auf Fibrillen zu erhalten. Diese molekulare Momentaufnahme ermöglichte es, die entscheidenden Komponenten der Zellreaktion auf Fibrillen zu identifizieren, die als potenzielle Biomarker in Betracht gezogen werden können. Neben der Untersuchung der Auswirkungen von Fibrillen auf Zellen bleibt die Untersuchung von Oligomeren ein wichtiges Thema, da diese oft als die toxische Spezies beschrieben werden. Oligomere sind jedoch aufgrund ihrer instabilen Natur, ihres geringen Vorkommens unter Standardbedingungen und ihrer strukturellen Heterogenität schwer zu untersuchen. Daher haben wir ein Oligomermodell entwickelt, dass die Untersuchung der Oligomere eines bestimmten Phänotyps (genannt curvilinear) ermöglicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung von intrinsisch ungeordneten Regionen als Vermittler der Hemmung der Amyloidbildung. Sie können die Entwicklung von Inhibitoren leiten und ihr hemmendes Potenzial verbessern. Außerdem bieten sie eine neue Perspektive, um die Selbstinteraktion des aggregierenden Proteins für die Hemmung zu nutzen. Darüber hinaus tragen sie zum Verständnis der einzelnen Schritte der Amyloidbildungsreaktion bei. Das Untersuchen der Rolle von verschiedenen Aggregationszuständen, ihre pathophysiologischen Auswirkungen und das zelluläre Reaktionssystem liefern wertvolle Erkenntnisse, um unser Verständnis dieser Fehlfaltungskrankheiten zu vertiefen. Worldwide, a high number of patients are affected by protein misfolding diseases, caused by the formation of insoluble amyloid fibrils that accumulate as protein deposits. Amyloid fibrils represent highly ordered, insoluble protein aggregates with a characteristic cross-β⁠ conformation. Various sequences, despite their dissimilarity, can adopt this conformation and aggregate, a phenomenon frequently observed in amyloid diseases like Alzheimer’s (AD) or Parkinson’s diseases (PD). This thesis delves into two primary topics, examining the mechanistic role of the intrinsically disordered regions (IDRs) in amyloid formation and inhibition of α-synuclein (αS), as well as exploring the pathophysiological effects on cells induced by various aggregation species. In the first part, the modes of action of amyloid inhibitors were under investigation. Inhibitors of amyloid formation can target different sites, such as the fibril ends to prevent elongation. Previously, the engineered protein WT-CC48, which is a fusion of wildtype (WT) αS with the disulfide-containing αS mutant CC48, exhibited high potential to inhibit fibril elongation. Here, we studied which regions of WT-CC48 are responsible for the strong inhibitory effect by characterizing a set of truncated versions of WT-CC48. We show that in both the WT and the CC48 part of the fusion construct the regions required for strong inhibition correspond to the segments forming the β-sheet core of αS fibrils. This suggests that coverage of the full β-sheet core interface exposed at the fibril end is beneficial for optimization of fibril elongation inhibitors. Surprisingly, even an αS monomer binding protein can achieve substoichiometric inhibition of αS aggregation. The engineered binding protein β-wrapin AS69 sequesters monomeric αS in the region of amino acid 30-60, while the remaining sequence stays intrinsically disordered. We could show that this substoichiometric activity requires not only the globular part of the complex but also the IDRs of αS. This means that the ability of IDRs to interfere with amyloid formation can be exploited by inhibitors to inhibit specific mechanisms in vitro and in cellular aggregation assays. On this basis, an inhibitor called AS69nuc was developed that specifically inhibits the nucleation of αS fibrils, but not their elongation. The use of AS69nuc as an artificial tool gained valuable insights into aggregation proliferation in the diagnostic seeded amplification assay (SAA). Our findings reveal that under SAA conditions, secondary nucleation drives the proliferation initiated by PD patients’ cerebrospinal fluid (CSF). The second part of this thesis is centered around the understanding of cellular internalization and pathophysiological effects of fibrils and oligomeric species. Next generation sequencing (NGS) was performed to provide insights into cellular response systems against fibrils. This molecular snapshot allowed to identify the critical components of the cell response to fibrils, which may be further considered as potential biomarkers. In addition to looking at the impact of fibrils on cells, the study of oligomers remains an important issue, as these are often described as the toxic species. However, oligomers are difficult to study due to their transient nature, low population under standard conditions, and structural heterogeneity. Therefore, we developed an oligomer model, which enables the investigation of the effects of stable curvilinear oligomers. The findings in this thesis highlight the significance of IDRs as facilitators of inhibition of amyloid formation. They can guide the design of inhibitors, enhancing their inhibitory potential, and offer a fresh perspective to exploit the aggregating protein’s self-interaction for inhibition. Moreover, they contribute to the understanding of the individual steps of the amyloid formation reaction. Shedding light on the roles of various aggregation species, their pathophysiological effects, and the cellular response system is consistently intriguing, providing valuable insights to deepen our understanding of amyloid diseases.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	02.10.2025
Dateien geändert am:	02.10.2025
Promotionsantrag am:	19.03.2024
Datum der Promotion:	20.07.2024