Dokument: RNA-cleaving DNAzymes: an approach to treat viral infections?

Titel:	RNA-cleaving DNAzymes: an approach to treat viral infections?
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=66486
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250818-084345-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kirchgässler, Nina Maria [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 22,67 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.08.2024 / geändert 05.08.2024
Beitragende:	Jun.-Prof. Dr. Span, Ingrid [Gutachter] Prof. Dr. Axmann, Ilka [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	DNAzymes are artificially obtained, single-stranded DNA molecules that are capable of catalyzing chemical reactions. For therapeutic approaches, RNA-cleaving DNAzymes are of particular interest, which catalyze the site-specific cleavage of RNA substrates depending on divalent metal ions as cofactor. One of the most prominent RNA-cleaving DNAzymes is the 10-23 DNAzyme (Dz). The Dz consists of a catalytic core that is flanked by two substrate binding arms, of which the latter can be designed to target almost any sequence of interest. Recent high resolution structural data on the Dz:RNA complex shed light on the Dz’s cleavage mechanism and closed a long lasting gap of missing information. Although the Dz was discovered more than 20 years ago by in vitro selection, low in vivo activity remains a persisting challenge. Despite promising progress using chemically modified building blocks, it is poorly understood how the cellular environment is able to interfere with Dz activity. Here, molecular crowding is suspected as cause, which summarizes physicochemical consequences that result from unspecific interactions within the heterogeneous and densely packed environment in cells. Thus, the present work aims at investigating effects by molecular crowding on the activity and structure of the Dz. The goal is to contribute to a better understanding of the molecular interplay that might point towards new modification strategies to help overcome in vivo limitations. In order to investigate molecular crowding in vitro, it is key to simulate conditions that resemble cells. The first article (Kirchgässler et al. (2022) Protocol for molecular crowding analyses) provides a protocol for mimicking a cell-like environment in vitro and analyzing a Dz’s stability and activity in presence of them. Additional hints for handling crowded solutions and DNAzymes are given. The simulation of crowded conditions is obtained using osmolytes and polymers polyethylene glycol and dextran as cosolutes. The protocol includes detailed instructions for a Förster Resonance Energy Transfer-based cleavage assay, denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis, and circular dichroism spectroscopy. In the second article (Molecular crowding: impacts on the activity of the 10-23 DNAzyme), studies on the Dz under crowded conditions, including the methods presented in article one, are pursued and expanded by determining physicochemical solution properties and providing first information on the Dz:RNA complex structure. The latter was obtained by fluorescence correlation spectroscopy and small-angle X-ray scattering. The data show that depending on the cosolute’s nature and concentration, Dz activity is reduced or at certain conditions even increased. In a promoting surrounding, preferences in crowded conditions tend to differ between cofactors Mg2+ and Mn2+. Analyses on the size and shape of the Dz:RNA complex indicate less structural impact by molecular crowding. This study provides important first insights on how cellular conditions potentially influence the performance of the Dz and presents cofactor dependencies for the first time. As cells contain a diversity of biomolecules, resembling their complexity in vitro is challenging. Thus, in a perspective, article 3 (Extending crowding in vitro), the conditions under which previous crowding studies with the focus on DNAzymes have been performed are compared and discussed with regard to the applied cosolute and buffer as well as used RNA substrate length. The critical analysis outlines options for adjustment to gradually increase system complexity, which will help to gain deeper insights on molecular crowding effects in future attempts. Apart from molecular crowding analyses, this work also deals with examining the therapeutic potential of the Dz to target viral infections beyond human pathogens, in which fish farming is selected as field of interest (Article 4: Use of the 10-23 DNAzyme to target fish viruses). One of the most dominating diseases is mediated by the viral hemorrhagic septicaemia virus, which is selected as target. Dz are designed to bind and cleave the RNA sequence that codes for the nucleocapsid protein due to its crucial function in viral replication. For the very first time, we present three potential candidates that are stable and able to perform site-specific cleavage under the tested conditions targeting VHSV. The results provide an initial base to further explore the antiviral potential of DNAzymes in fish. DNAzyme sind artifizielle, einzelsträngige DNA-Moleküle, die in der Lage sind, chemische Reaktionen zu katalysieren. Für therapeutische Zwecke sind RNA-spaltende DNAzyme von besonderem Interesse, die die sequenzspezifische Spaltung von RNA-Substraten in Abhängigkeit von divalenten Kationen als Cofaktoren katalysieren. Eines der bekanntesten RNA-spaltenden DNAzyme ist das 10-23 DNAzym (Dz). Das Dz besteht aus einem katalytischem Kern, der von zwei Substratbindearmen flankiert wird. Letztere lassen sich in ihrer Sequenz variable an nahezu jedes RNA-Substrat anpassen. Eine erst kürzlich veröffentlichte, hochaufgelöste Struktur des Dz:RNA-Komplexes liefert neue Hinweise auf den Katalysemechanismus und schließt damit eine lang bestehende Informationslücke. Obwohl das Dz bereits vor mehr als zwei Jahrzehnten mittels in vitro-Selektion selektiert wurde, ist dessen geringe in vivo-Aktivität eine bestehende Herausforderung. Trotz vielversprechender Fortschritte bei der Verwendung von chemisch modifizierten Bausteinen, ist es nur unzureichend geklärt, inwiefern das zelluläre Umfeld die Aktivität des Dz beeinflussen kann. Hier wird das molekulare Gedränge (Molecular Crowding) als eine mögliche Ursache vermutet, welches die physikochemischen Konsequenzen zusammenfasst, die aus den unspezifischen Wechselwirkungen innerhalb des heterogenen und dicht gepackten Umfelds in Zellen resultieren. Ziel dieser Arbeit ist es daher die Auswirkungen des molekularen Gedränges in Zellen auf die Aktivität und Struktur des Dz zu untersuchen, die zu einem besseren Verständnis des molekularen Zusammenspiels beitragen sollen und neue, mögliche Modifizierungsstrategien öffenbaren könnten. Um das molekulare Gedränge in vitro untersuchen zu können, ist es wichtig zellnahe Bedingungen zu simulieren. Der erste Artikel (Kirchgässler et al. (2022) Protocol for molecular crowding analyses) beinhaltet ein Protokoll um solche in vitro zu simulieren und die Aktivität und Stabilität des Dz unter diesen zu untersuchen. Darüber hinaus werden Hinweise zum Umgang mit gedrängten Lösungen und DNAzymen aufgeführt. Die gedrängten Bedingungen werden unter Verwendung von Osmolyten und den Polymeren Polyethylenglykol und Dextran als Kosolute simuliert. Das Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für eine Förster-Resonanz-Energie-Transfer-basierte Spaltungsanalyse, denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Zirkulardichroismus-Spektroskopie. Im zweiten Artikel (Molecular crowding: impacts on the activity of the 10-23 DNAzyme) werden die Untersuchungen des Dz unter gedrängten Bedingungen, einschließlich der in Artikel 1 vorgestellten Methoden, fortgeführt und durch die Bestimmung von physikochemischen Lösungseigenschaften und der Lieferung erster Informationen zur Struktur des Dz:RNA-Komplexes erweitert. Letztere wurden mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie und Kleinwinkel-Röntgenstreuung gewonnen. Die Daten zeigen, dass in Abhängigkeit von der Art und Konzentration des Kosolutes die Aktivität des Dz reduziert oder unter bestimmten Bedingungen sogar erhöht wird. In einer aktivitätsfördernden Umgebung zeigen die von den beiden Cofaktoren Mg2+ und Mn2+ bevorzugten Bedingungen unterschiedliche Tendenzen auf. Die Analysen zur Größe und Form des Dz:RNA-Komplexes deuten auf einen geringen, strukturellen Einfluss durch das molekulare Gedränge hin. Diese Studie liefert erste, wichtige Erkenntnisse darüber, wie zelluläre Bedingungen die Leistung des Dz möglicherweise beeinflussen und zeigt zum ersten Mal Kofaktor-Abhängigkeiten auf. Da sich Zellen aus einer Vielzahl von verschiedenen Biomolekülen zusammensetzen, ist es eine Herausforderung ihre Komplexität in vitro widerzuspiegeln. Daher werden in Artikel 3 (Extending crowding in vitro) die Bedingungen, unter denen bisherige Studien unter gedrängten Bedingungen mit Schwerpunkt auf DNAzymen durchgeführt wurden, verglichen und im Hinblick auf die verwendeten Kosolute und Puffer, sowie RNA-Substratlängen diskutiert. Die kritische Analyse arbeitet Anpassungsmöglichkeiten heraus, um eine graduelle Erhöhung der Systemkomplexität zu gewährleisten, die es in zukünftigen Studien ermöglichen soll noch tiefere Einblicke in die Einflüsse des molekularen Gedränges zu gewinnen. Neben diesen Analysen befasst sich die vorliegende Arbeit auch mit der Untersuchung des therapeutischen Potenzials des Dz zur Bekämpfung von Virusinfektionen jenseits von Humanpathogenen, wobei die Fischzucht als Interessensgebiet betrachtet wird (Artikel 4: Use of the 10-23 DNAzyme to target fish viruses). Eine der dominierenden Krankheiten wird durch das virale hämorrhagische Septikämievirus hervorgerufen, das als Ziel ausgewählt wurde. Dz wurden zur Bindung und Spaltung der RNA-Sequenz des Nukleokapsidproteins entworfen, welches eine entscheidende Funktion bei der viralen Replikation einnimmt. Zum ersten Mal stellen wir drei potenzielle Kandidaten vor, die unter den getesteten Bedingungen stabil und in der Lage sind, die RNA des VHSV sequenzspezifisch zu spalten. Die Ergebnisse bilden eine erste Grundlage für die weitere Untersuchung des antiviralen Potenzials von DNAzymen in Fischen.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	18.08.2025
Dateien geändert am:	18.08.2025
Promotionsantrag am:	02.03.2024
Datum der Promotion:	18.06.2024