Dokument: Weiterentwicklung und Anwendung der sFIDA-Technologie für den quantitativen Nachweis von Proteinaggregaten zur Diagnose von Proteinfehlfaltungserkrankungen
| Titel: | Weiterentwicklung und Anwendung der sFIDA-Technologie für den quantitativen Nachweis von Proteinaggregaten zur Diagnose von Proteinfehlfaltungserkrankungen | |||||||
| Weiterer Titel: | Development and application of the sFIDA technology for the quantitative detection of protein aggregates for the diagnosis of protein misfolding diseases | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=66363 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20250723-082713-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Pils, Marlene Maximiliane [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Hoyer, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Bayer, Peter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Assay-Entwicklung, Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, Schizophrenie | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Proteinfehlfaltungserkrankungen einschließlich Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson sowie eine Subgruppe chronisch mentaler Erkrankungen zeichnen sich durch die Aggregation und Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen beispielsweise des Aβ-Peptids, Tau-, α-Synuclein- und DISC1-Proteins aus. Insbesondere die während der Aggregation gebildeten Proteinoligomere scheinen die wichtigste toxische Spezies zu sein. Folglich stellen sie einen vielversprechenden Biomarker-Kandidaten sowohl für die Diagnostik als auch für die Medikamentenentwicklung dar. Die Detektion und Quantifizierung von Proteinoligomeren aus menschlichem Gewebe oder Körperflüssigkeiten ist aufgrund der geringen Konzentration, Heterogenität und Stabilität herausfordernd, was die Entwicklung einschließlich Verifizierung und Validierung hochsensitiver und spezifischer diagnostischer Verfahren fordert. Die oberflächenbasierte Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (englisch: surface-based fluorescence intensity distribution analysis, sFIDA) ist eine Plattformtechnologie, welche die Quantifizierung und Größenbestimmung einzelner Proteinaggregate ermöglicht, indem die Spezifität eines Immunoassays mit der Sensitivität hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie kombiniert wird.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Verifizierungsplan zu etablieren und mit dessen Hilfe unterschiedliche sFIDA-Assays für den Nachweis amyloider Proteinaggregate zu entwickeln. Hierzu wurde eingangs anhand von synthetischen Aβ-Aggregaten und Aβ-konjugierten Silikananopartikeln demonstriert, dass innerhalb der Verifizierung durch Eruierung der Coating-Parameter, Optimierung der Blockadelösung und des Proben- oder Detektionssondenpuffers sowie Wahl und Titration der Assay-Antikörper die analytische Sensitivität und Spezifität des Assays gesteigert werden konnte. Durch Implementierung einer Oligomer-basierten internen Qualitätskontrollprobe wurde die Standardisierung und Routineanwendung der sFIDA-Technologie für den Nachweis von Aβ-Aggregaten erhöht. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Detektion und Quantifizierung von Proteinaggregaten bestehend aus Aβ, Tau, α-Synuclein oder DISC1 mittels den entwickelten sFIDA-Assays bis zu femtomolaren Nachweisgrenzen in Liquorproben möglich war. Ein weiterer wichtiger Teil der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung weniger bzw. nicht-invasiver Methoden, welche nun die Quantifizierung von Proteinaggregaten in komplexeren Matrices wie Plasma oder Stuhl mittels sFIDA gewährleisten. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit der sFIDA-Technologie im Bereich der präklinischen Arzneimittelentwicklung zur Untersuchung des Wirkmechanismus oder des ex-vivo Target-Engagement in zwei Studien bestätigt. Zusammenfassend dienen diese Ergebnisse als Grundlage für weitere Entwicklungsarbeiten und zukünftige Studien, welche die analytische und klinische Leistung der sFIDA-Technologie bewerten und so den Übergang aus der Forschung in das regulierte Umfeld der in-vitro-Diagnostika ermöglichen.Protein misfolding diseases including Alzheimer's disease, Parkinson's disease as well as a subset of chronic mental diseases are characterized by aggregation and accumulation of misfolded proteins e.g. Aβ peptide, tau, α-synuclein and DISC1 protein. Especially the small and soluble protein oligomers formed during aggregation are considered the most toxic species. Consequently, oligomers represent a promising biomarker candidate for both diagnostics and drug development, respectively. Detection and quantification of such protein oligomers in human tissues or body fluids is still challenging due to their low concentration, heterogeneity, and stability. Hence, the development of highly sensitive and specific diagnostic methods is required including assay verification and validation. The surface-based fluorescence intensity distribution analysis (sFIDA) is a platform technology that enables quantification and sizing of single protein aggregates by combining the specificity of an immunoassay with the sensitivity of high-resolution fluorescence microscopy. The aim of the present work was to establish a verification protocol and apply it to develop different sFIDA assays for the detection and quantification of amyloid protein aggregates. Using synthetic Aβ-aggregates and Aβ-coated silica nanoparticles, it was shown that within assay verification the analytical sensitivity and specificity was increased by determination of coating parameters, optimization of buffer compositions of blocking, sample, or detection buffers as well as choice and titration of assay antibodies. By implementing an oligomer-based internal quality control sample, the standardization and routine application of the sFIDA technology for the detection of Aβ-aggregates could also be improved. Furthermore, it was shown that the detection and quantification of protein aggregates in human CSF samples consisting of Aβ, tau, α-synuclein, or DISC1 was possible down to low-femtomolar detection limits using the developed sFIDA assays. Another important part of the present work was the development and validation of less or non-invasive methods that now ensure the sensitive detection and accurate quantification of protein aggregates in more complex matrices such as plasma or stool using sFIDA. In addition, the applicability of sFIDA technology in the field of preclinical drug development to study the mechanism of action or ex vivo target engagement has been confirmed in two different studies. In conclusion, these results of the present work provide a fundamental step for future assay developmental work and diagnostic studies evaluating the analytical as well as clinical performance of sFIDA technology, enabling the transition from research to the regulated environment of in-vitro diagnostics. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 23.07.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 23.07.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 18.10.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 26.03.2024 |
