Dokument: Halopseudomonas spp. – Etablierung molekularbiologischer Methoden und Untersuchung der Stresstoleranz einer neuen Bakteriengattung

Titel:	Halopseudomonas spp. – Etablierung molekularbiologischer Methoden und Untersuchung der Stresstoleranz einer neuen Bakteriengattung
Weiterer Titel:	Halopseudomonas spp. - Establishment of molecular biological methods and investigation of the stress tolerance of a new bacterial genus
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=66312
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240701-093249-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kruse, Luzie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 26,46 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 29.06.2024 / geändert 29.06.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Wierckx, Nick [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Gattung Halopseudomonas bildet eine einzigartige phylogenetische Gruppe im Stammbaum der Pseudomonadaceae, wovon die meisten Vertreter erst innerhalb des letzten Jahrzehnts isoliert wurden. Obwohl sie ein vergleichsweise kleines Genom haben, was auf eine limitierte metabolische Flexibilität hindeuten könnte, gelten sie als eurytherm und euryhalin. Zudem leben sie natürlicherweise in extremen Habitaten, wie der Tiefsee oder mit Öl-, bzw. Schwermetallen-kontaminierten Böden. Mehrere Vertreter der Gattung wurden bereits mit dem Abbau anthropogener Substanzen in der Umwelt in Verbindung gebracht. Aufgrund dieser Eigenschaften stellen die Halopseudomonas-Arten vielversprechende Kandidaten für biotechnologische Anwendungen dar, für die in dieser Arbeit die Grundlagen für die Erforschung und Anwendung bereitgestellt wurden. Um diese Gattung näher zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit stellvertretend vier Kandidatenstämme aus unterschiedlichen Habitaten (Öl- oder Schwermetall-kontaminierte Böden, Gezeitenzone oder Tiefsee) ausgewählt: H. aestusnigri VGXO14, H. bauzanensis BZ93, H. litoralis 2SM5 und H. oceani KX20. Als Grundvoraussetzung der mikrobiologischen Zugänglichkeit wurden geeignete Kultivierungsmethoden in Komplex- und Minimalmedien identifiziert. Hierbei erwiesen sich kurz- (C4) und auch langkettige (> C6) Dicarbonsäuren als besonders geeignete Kohlenstoffquellen. Ergänzend zu den Kultivierungsprotokollen wurden verschiedene gentechnische Werkzeuge verwendet. Hierzu zählten unter anderem unterschiedliche Transformationstechniken mit Plasmidsystemen, die divers kompatible Replikationsursprünge trugen. Außerdem ließen sich via Tn7-Transposition Geninsertionen in die zwei attTn7-Loci von H. litoralis realisieren. Zur Steuerung der heterologen Genexpression wurden darüber hinaus konstitutive und induzierbare Promotorsysteme evaluiert. Dabei konnte für das AraC/PBAD-System gezeigt werden, dass die Induktion mit einer deutlich geringeren Induktorkonzentration als bei P. putida erfolgreich war. Diese Arbeiten dienten als Grundlage, um die Osmotoleranz der Halopseudomonas-Arten nähergehend zu untersuchen. Hierzu wurde zunächst die phänotypische Reaktion der Kulturen bei Zugabe verschiedener Salze getestet. In allen vier ausgewählten Halopseudomonas Stämmen konnte erstmals die Produktion von sowohl Ectoin als auch 5-Hydroxyectoin nachgewiesen werden, obwohl das Gen der Ectoinhydroxylase ectD nicht in allen Genomen konserviert war. Eine potenziell neue Gruppe von Ectoinhydroxylasen konnte in H. aestusnigri und H. oceani identifiziert werden, die diese Reaktion stattdessen katalysieren könnten. Mit Hilfe einer gesteigerten Expression von ectD konnten die Produktion von 5-Hydroxyectoin in Relation zu Ectoin erhöht und so die Rolle dieses Osmolyts in der Osmotoleranz untersucht werden. Zur Evaluation der salzinduzierten Stressantwort auf Transkriptebene wurden entsprechende Transkriptomstudien in H. litoralis durchgeführt., wobei eine zweiphasige Stressantwort beobachten wurde. In der frühen Phase konnten typische Stressreaktionen, wie eine gesteigerte Expression von Chaperon- und Energiehomöostase-assoziierten Genen beobachtet werden. Darüber hinaus waren Transkripte zur Produktion von mechanosensitiven Kanälen und verschiedener kompatibler Solute hoch abundant, während Transkripte zur Biosynthese von Flagellen niedrige Transkriptlevel aufwiesen. In der späten Phase waren Transkripte hoch abundant, die im Zusammenhang mit der Eisenaufnahme stehen. Daraus folgernd führte die externe Zugabe von Eisensulfat zu einer Regeneration des bakteriellen Wachstums unter osmotischem Stress. Insgesamt gelang die Etablierung mikrobiologischer Kultivierungskonzepte und molekularbiologischer Methoden von vier ausgewählten Halopseudomonas-Arten. Hierbei wurde erstmals die Produktion des biomedizinisch relevanten Ectoins und 5-Hydroxyectoins, sowie eine zweistufige Reaktion bei osmotischem Stress auf Transkriptebene für diese Bakterien nachgewiesen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der Grundstein gelegt, um die Gattung Halopseudomonas biotechnologisch nutzbar zu machen. The Halopseudomonas species form a unique phylogenetic group in the phylogenetic tree of Pseudomonadaceae, most of those representatives have only been isolated within the last decade. Although they have a comparatively small genome, which may indicate limited metabolic flexibility, they are considered eurythermic and euryhaline. In addition, they naturally live in extreme habitats such as the deep sea or soils contaminated with oil or heavy metals. Several representatives of this genus have already been associated with the degradation of anthropogenic substances in the environment. Due to these properties, Halopseudomonas spp. are promising candidates for biotechnological applications. In order to investigate this genus in more detail, four candidate strains from different habitats (oil- or heavy metal-contaminated soil, intertidal zone or deep sea) were selected as representatives in this study: H. aestusnigri VGXO14, H. bauzanensis BZ93, H. litoralis 2SM5 and H. oceani KX20. Suitable cultivation methods in complex and minimal media were identified as a basic prerequisite for their microbiological accessibility. Short (C4) and long-chain (> C6) dicarboxylic acids proved to be particularly suitable carbon sources. In addition to the cultivation protocols, various genetic engineering tools were used. These included different transformation techniques with plasmid systems that carried diverse compatible origins of replication. Besides, gene insertions into the two attTn7 loci of H. litoralis could be realised via Tn7 transposition. Constitutive and inducible promoter systems were also evaluated to control heterologous gene expression. It was further shown that the induction of the AraC/PBAD system required significantly lower inducer concentration compared to P. putida. This work served as the basis for investigating the osmotolerance of Halopseudomonas spp. in more detail. To this end, the phenotypic reaction of the cultures was first elucidated when different salts were added. The production of both ectoine and 5 hydroxyectoine was detected in all four selected Halopseudomonas strains for the first time, although the ectoine hydroxylase ectD was not conserved in all genomes. A potentially new group of ectoine hydroxylases was identified in H. aestusnigri and H. oceani that could presumably catalyse this reaction instead. By increasing the expression of ectD, the production of 5-hydroxyectoine was increased in comparison to ectoine and thus the role of this osmolyte in osmotolerance could be investigated. To determine the salt-induced stress response at the transcript level, corresponding transcriptome studies were carried out in H. litoralis, whereby a two-phase stress response was observed. In the early phase, typical stress responses such as increased expression of chaperone- and energy homeostasis-associated genes were observed. In addition, transcripts to produce mechanosensitive channels and various compatible solutes were highly abundant, while transcripts for the biosynthesis of flagella showed low transcript levels. In the late phase, transcripts associated with iron uptake were highly abundant. Subsequently, the external addition of ferrous sulphate led to a regeneration of bacterial growth under osmotic stress conditions. Overall, establishing microbiological cultivation concepts and molecular biological methods for four selected Halopseudomonas species was successful. The production of the biomedically relevant ectoine and 5-hydroxyectoine as well as a two-stage reaction under osmotic stress at transcript level was demonstrated for the first time for these bacteria. In summary, this work has laid the foundation for the biotechnological utilisation of the genus Halopseudomonas.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	01.07.2024
Dateien geändert am:	01.07.2024
Promotionsantrag am:	20.12.2023
Datum der Promotion:	23.05.2024