Dokument: Optimization of Fungal Aryl-Alcohol Oxidases for the Production of Flavor, Fragrances and Value-added Aldehydes

Titel:	Optimization of Fungal Aryl-Alcohol Oxidases for the Production of Flavor, Fragrances and Value-added Aldehydes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=66199
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240621-081029-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Jankowski, Nina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 21,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.06.2024 / geändert 19.06.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Aryl-alcohol oxidases (AAOs) are FAD-containing fungal oxidoreductases that catalyze the oxidation of primary aromatic or allylic alcohols to the corresponding aldehyde or, if present as gem-diol, to the acid with the concomitant reduction of O2 to H2O2. In nature, these enzymes are secreted by white-rot wood-decaying fungi and participate in the degradation of lignin, the world’s second most abundant natural heteropolymer. The biotechnological exploitation of AAOs is mainly aiming at the production of valuable aldehydes such as the flavors and fragrances benzaldehyde and trans-2-hexenal, the production of acids such as 2,5-furandicarboxylic acid (FDCA), a precursor for polyethylene furanoate (PEF) with high prospects of substituting fossil-based polymers, or the enzymatic supply of H2O2 to peroxidase or peroxygenase-catalyzed reactions. Another potential application lies in the participation of AAOs in efficient lignin utilization. However, the number of characterized AAOs is still very low, because the biochemical and structural investigation of these enzymes, as well as their broader application, has been largely hampered by the low production in native fungal hosts. Moreover, the reported heterologous systems often did not lead to higher enzyme titres as compared to production by native fungal hosts. Therefore, to explore and finally utilize AAOs’ full potential as biocatalysts, an efficient expression system is required to provide the recombinant enzymes at high yields and their substrate scope and catalytic potential need to be investigated. Only a few examples of sufficient AAO expression in recombinant yeasts have been published, which urged us to search for new AAO-encoding genes for heterologous expression. The methylotrophic yeast Pichia pastoris (recently re-classified as Komagataella phaffii) was chosen as expression host, because it can efficiently produce recombinant proteins and enables their glycosylation. The genes encoding five AAOs were heterologously expressed in P. pastoris (Chapter I). Two of them were produced in secreted form in fed-batch processes at high yields of 315 mg/l for PeAAO2 from Pleurotus eryngii P34 and 750 mg/l for MaAAO from Moesziomyces antarcticus (Chapters II and III). The thorough biochemical investigation of PeAAO2 and MaAAO has revealed that both enzymes are promising biocatalysts, since they are thermo- and pH stable, and convert a wide range of substrates with high activity. Moreover, a handful of previously unknown AAO substrates was identified, whose products find application as flavor and fragrance compounds or pharmaceutical building blocks. The amino acid sequence alignment of PeAAO2 and the non-expressible in P. pastoris PeAAO1 from a different P. eryngii substrain showed that the two enzymes differ in only 7 amino acids in the mature protein (Chapter IV). Iterative introduction of the respective amino acids from PeAAO2 into PeAAO1 led to the generation of PeAAO1 variant ER, which contained two adjacent amino acid exchanges (K583E/Q584R) and achieved even higher activity in cell-free supernatant than wild-type PeAAO2, after expression and secretion by P. pastoris. The homology model of the variant ER indicated a newly formed salt bridge at position 583, which is not present in the wild-type PeAAO1 and may therefore improve protein folding and stability of the respective variant. A new agar plate based activity assay was developed for the rapid screening of P. pastoris mutant libraries for improved activity towards selected substrates (Chapter V). Several strains expressing PeAAO1 variants and wild-type PeAAO2 were used for assay validation. The correlation between the observed volumetric activity in a liquid spectrophotometric assay and the color development on the agar plate underscores the usability and reliability of this assay for the rapid identification of the AAO variants with improved activity. In directed evolution campaigns involving the introduction of multiple randommutations and the generation of hundreds of individual P. pastoris transformants, the secretion and activity towards a specific substrate can be easily visualized using this agar plate based assay without the need for laborious cultivation in liquid medium, thus reducing the material, cost and time required. Oxidation of two newly discovered AAO substrates lead to the corresponding products piperonal and trans-2-cis-6-nonadienal. Both aldehydes are of considerable interest to the flavor and fragrance industry, because they are fragrances with very pleasant odors. Produced via AAO-catalyzed reactions they can be advertised as “natural fragrance”, meeting consumer demand for all-natural products. The biocatalytic production of piperonal was optimized on a small scale with respect to substrate concentration, shaking speed and temperature. The addition of catalase to degrade H2O2 and to re-introduce O2 was found to be essential and resulted in almost full conversion of 300 mM substrate within 44 h under optimized conditions (Chapter VI). The reaction was then scaled up to 10 ml volume, and the preparative production of piperonal resulted in a space-time yield of 9.5 g/l/h. The product was obtained with a high product yield of 85 % and more than 99 % purity via a simple extraction with n-hexane. trans-2-cis-6-Nonadienal and cuminal were produced under the same optimized conditions on a small scale. Cuminal, the oxidation product of cumic alcohol, is reported to possess various therapeutic effects such as anticancer and antidiabetic. Its AAO-mediated biocatalytic production could be of interest to the pharmaceutical industry. Taken together, the newly discovered and characterized AAOs, PeAAO2 and MaAAO, have demonstrated their high potential as biocatalysts with applications in the synthesis of potent pharmaceutical and flavor and fragrance compounds. Arylalkohol-Oxidasen (AAOs) sind FAD-haltige Oxidoreduktasen aus Pilzen, die die Oxidation primärer aromatischer oder allylischer Alkohole zu den entsprechenden Aldehyden oder, wenn gem-Diole vorliegen, zur Säuren, katalysieren, wobei gleichzeitig O2 zu H2O2 reduziert wird. In der Natur werden diese Enzyme von holzzersetzenden Weißfäulepilzen ausgeschieden und sind am Abbau des Pflanzenmaterials Lignin, dem zweithäufigsten natürlichen Heteropolymer der Welt, beteiligt. Die biotechnologische Nutzung von AAOs zielt vor allem auf die Produktion von wertvollen Aldehyden wie die Aroma- und Duftstoffe Benzaldehyd und trans-2-Hexenal, auf die Produktion von Säuren wie 2,5-Furandicarbonsäure (FDCA), einer Vorstufe für Polyethylenfuranoat (PEF), das fossile Polymere ersetzen könnte, oder auf die enzymatische Bereitstellung von H2O2 für Peroxidase- oder Peroxygenase-katalysierte Reaktionen ab. Eine weitere mögliche Anwendung ist die Beteiligung von AAOs an einer effizienten Ligninverwertung. Die Zahl der charakterisierten AAOs ist jedoch noch sehr gering, da die biochemischen und strukturellen Untersuchungen dieser Enzyme sowie ihre breitere Anwendung durch die geringe Produktion in nativen Pilzwirten weitgehend beeinträchtigt wurden. Darüber hinaus führte die Produktion in heterologen Systemen oft zu kaum höheren Ausbeuten als die Produktion in nativen Pilzwirten. Um jedoch das volle Potenzial von AAOs als Biokatalysatoren erforschen und nutzen zu können, müssen die rekombinanten Enzyme mit hoher Ausbeute hergestellt, und ihr Substratspektrum sowie ihre physikalischen Eigenschaften untersucht werden. Es wurden nur wenige Beispiele für die sekretorische Produktion mit Hefeexpressionssystemen mit ausreichend hohen Produktausbeuten veröffentlicht, was die Suche nach AAO-kodierenden Genen für die heterologe Expression veranlasste. Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris (re-klassifiziert als Komagataella phaffii) wurde als Expressionswirt ausgewählt, da sie effizient rekombinante Proteine herstellt und deren Glykosylierung ermöglicht. In dieser Arbeit wurden die Gene, die für fünf AAOs kodieren, rekombinant in P. pastoris exprimiert (Kapitel I), und zwei von ihnen wurden sezerniert und in Fed-Batch-Verfahren in hohen Ausbeuten von 315 mg/l für PeAAO2 aus Pleurotus eryngii P34 und 750 mg/l für MaAAO aus Moesziomyces antarcticus produziert (Kapitel II und III). Die eingehende biochemische Untersuchung von PeAAO2 und MaAAO ergab, dass beide Enzyme vielversprechende Biokatalysatoren sind, da sie thermo- und pH-stabil sind und ein breites Spektrum von Substraten mit hoher Aktivität umsetzen. Darüber hinaus wurde eine Handvoll bisher unbekannter AAO-Substrate identifiziert, deren Produkte als Aroma- und Duftstoffe oder pharmazeutische Bausteine Verwendung finden. Das Aminosäuresequenz-Alignment von PeAAO2 und der in P. pastoris nicht exprimierbaren PeAAO1 aus einem anderen P. eryngii-Unterstamm zeigte, dass sich die beiden Enzyme in 7 Aminosäuren im reifen Protein unterscheiden (Kapitel IV). Die iterative Einführung der entsprechenden Aminosäuren aus PeAAO2 in PeAAO1 führte zur Erzeugung der PeAAO1-Variante ER, die zwei benachbarte Aminosäureaustausche (K583E/Q584R) enthielt und im zellfreien Expressionsüberstand sogar eine höhere Aktivität als der Wildtyp PeAAO2 aufwies. Das Homologiemodell der ER-Variante wies auf eine neu gebildete komplexe Salzbrücke an Position 583 hin, die sich im Wildtyp-PeAAO1 nicht ausbilden kann und somit die Proteinfaltung und -stabilität der entsprechenden Variante verbessern könnte. Es wurde ein neuer, auf Agarplatten basierender Aktivitätstest für das schnelle Screening von P. pastoris-Mutantenbibliotheken auf erhöhte Aktivität gegenüber ausgewählten Zielsubstraten entwickelt (Kapitel V). Zur Validierung des Assays wurden mehrere P. pastoris Stämme verwendet, die PeAAO1-Varianten und den Wildtyp PeAAO2 exprimieren. Die Korrelation zwischen der beobachteten volumetrischen Aktivität in einem flüssigkeitsbasierten spektrophotometrischen Assay und der Farbentwicklung auf einer Agarplatte unterstreicht die Nützlichkeit und Zuverlässigkeit dieses Assays für die schnelle Identifizierung von AAO-Varianten mit höherer Aktivität. In gezielten Evolutionskampagnen, in denen mehrere Zufallsmutationen eingeführt und Hunderte von individuellen P. pastoris-Transformanten erzeugt werden, kann die Sekretion und Aktivität gegen ein bestimmtes Substrat mit diesem auf Agarplatten basierenden Assay leicht sichtbar gemacht werden, ohne dass eine mühsame Kultivierung in Flüssigmedium erforderlich ist, was den Material-, Kosten- und Zeitaufwand reduziert. Unter den neu entdeckten AAO-Substraten sind die entsprechenden Produkte Piperonal und trans-2-cis-6-Nonadienal für die Aromen- und Duftstoffindustrie von großem Interesse, da es sich bei beiden um Duftstoffe mit sehr angenehmen Geruch handelt, die als "natürliche Aromen" beworben werden können und damit dem Wunsch der Verbraucher nach natürlichen Produkten entgegenkommt. Die biokatalytische Herstellung von Piperonal wurde im kleinen Maßstab hinsichtlich Substratkonzentration, Schüttelgeschwindigkeit und Temperatur optimiert. Die Zugabe von Katalase zum Abbau von H2O2 und zur Rückführung von O2 erwies sich als unerlässlich und führte unter den optimierten Bedingungen zu einer nahezu vollständigen Umsetzung von 300 mM Substrat innerhalb von 44 Stunden (Kapitel VI). Die Reaktion wurde dann auf ein Reaktionsvolumen von 10 ml hochskaliert und die präparative Herstellung von Piperonal führte zu einer Raum-Zeit-Ausbeute von 9,5 g/l/h. Das Produkt wurde in einem einfachen Extraktionsschritt mit n-Hexan mit einer hohen Produktausbeute von 85 % und einer Reinheit von mehr als 99 % isoliert. Trans-2-cis-6-Nonadienal und Cuminal wurden unter den gleichen optimierten Bedingungen in kleinem Maßstab hergestellt. Cuminal, das Oxidationsprodukt von Cuminalalkohol, soll Berichten zufolge verschiedene therapeutische Wirkungen, wie z. B. krebshemmend und antidiabetisch haben. Seine AAO-vermittelte biokatalytische Produktion könnte für die pharmazeutische Industrie von Interesse sein. Insgesamt konnte das hohe Potenzial der neu entdeckten und charakterisierten AAOs, PeAAO2 und MaAAO, als Biokatalysatoren für die Synthese von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen sowie von Aroma- und Duftstoffen gezeigt werden.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	21.06.2024
Dateien geändert am:	21.06.2024
Promotionsantrag am:	12.09.2023
Datum der Promotion:	09.04.2024