Dokument: Entwicklung einer CD44v6-basierten CAR-T-Zell-Therapie für solide Kopf-Hals-Karzinome
| Titel: | Entwicklung einer CD44v6-basierten CAR-T-Zell-Therapie für solide Kopf-Hals-Karzinome | |||||||
| Weiterer Titel: | Development of a CD44v6-targeted CAR T cell therapy for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=66175 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240619-131213-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Schulte, Elena [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Hanenberg, Helmut [Gutachter] Prof. Dr. med. Norbert Gattermann [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die Fünf-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten mit Kopf-Hals-Platten- epithelkarzinomen (KHPEK) liegt auch unter den aktuellen Therapieschemata mit multimodalen Ansätzen nur bei 50 %. In den letzten sechs Jahren haben neuartige adoptive zelluläre Behandlungsmodalitäten bei Patienten mit infausten malignen B-Zell- Erkrankungen, bei denen die autologen T-Zellen mittels genetischer Modifikation mit sogenannten chimären Antigenrezeptoren (CARs) ausgestattet wurden, beeindruckende Remissions- und Überlebensraten erzielt. Dabei nutzen die CAR- Konstrukte ein Einzelkettenfragment (scFv) eines monoklonalen Antikörpers, das ein spezifisches Antigen auf den Zielzellen erkennt, damit die CAR-T-Zellen die malignen Zielzellen erkennen und abtöten können. Bislang sind jedoch nur wenige Zielantigene als potenzielle Kandidaten für eine CAR-T-Zell-Therapie bei KHPEK beschrieben worden. CD44v6, eine Spleißvariante des Adhäsionsmoleküls CD44, ist ein tumor- assoziiertes Antigen (TAA), das auf KHPEK häufig überexprimiert wird und somit ein potenziell geeignetes Ziel für eine derartige CAR-T-Zell-Therapie sein könnte. In dieser Arbeit sollte deshalb eine CD44v6-spezifische CAR-T-Zell-Therapie gegen KHPEK- Zellen in vitro etabliert werden.
In einem ersten Schritt wurde die CD44v6- und CD44-Expression bei 31 primären KHPEK-Zelllinien durchflusszytometrisch untersucht, wobei sich unterschiedliche Expressionen von CD44v6 und CD44 zeigten. Als Positivkontrolle wurde deshalb eine cDNA für CD44v6 stabil in der KHPEK-Zelllinie UT24A exprimiert. Ein CD44v6-CAR der zweiten Generation mit dem scFv-Fragment des monoklonalen Antikörpers BIWA8 und mit den Signalketten von humanem CD28 und der CD3ζ-Kette wurde durch lentiviralen Gentransfer stabil in primären humanen T-Zellen exprimiert und die transduzierten Zellen dann über eine CD34-abgeleitete hinge-Domäne mittels der MACS-Technologie zu >90 % angereichert. Um das zytotoxische Potenzial der genetisch modifizierten T- Zellen zu beurteilen, wurden diese mit KHPEK-Zelllinien für 16 Stunden kokultiviert und dann die Lyse der KHPEK-Zellen durchflusszytometrisch oder mit einem Zell- basierten Proliferationsassay bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Lyseeffizienz der genetisch veränderten T-Zellen vorwiegend von der Antigendichte auf den Zielzellen abhing: Zelllinien mit höheren CD44v6-Expressionsniveaus (UM14C, UM11B) wurden bereits bei niedrigen T-Zell- zu Zielzell-Verhältnissen effizient lysiert, während die naiven UT24A-Zellen mit niedriger CD44v6-Expression kaum eliminiert wurden. Die lentivirale Überexpression von CD44v6 erhöhte dann die Lyse der UT24A-Zellen durch die CAR- T-Zellen deutlich, was ein Hinweis für die Spezifität des CD44v6-CARs war. In dieser Arbeit wurde somit eine CD44v6-ausgerichtete CAR-T-Zell-Therapie etabliert, mit der in vitro KHPEK-Zellen effizient in kurzer Zeit eliminiert werden können. Zukünftige Ansätze sollten nun die CAR-T-Zellen vor dem immunsuppressiven Tumorenvironment von KHPEK besser schützen, zusätzliche Kombinationstherapien entwickeln, die Lyseeffizienz gegenüber den malignen Zellen weiter optimieren und die Toxizität gegenüber CD44v6-positiven gesunden Geweben weitgehend umgehen.The five-year survival probability of patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is only 50 %, even under current treatment regimens with multimodal approaches. Over the past six years, novel adoptive cellular treatment modalities for patients with infaust B-cell malignancies, in which the autologous T-cells are genetically modified with so-called chimeric antigen receptors (CARs), have achieved impressive remission and survival rates. The CAR constructs here use a single chain fragment (scFv) of a monoclonal antibody that recognizes a specific antigen on the target cells and allows the CAR T-cells to recognize and kill the malignant target cells. To date, however, only a few target antigens have been described as potential candidates for CAR T-cell therapy in HNSCC patients. CD44v6, a splice variant of the adhesion molecule CD44, is a tumor-associated antigen that is frequently overexpressed on HNSCC and could therefore be a potentially suitable target for CAR T-cell therapy. The aim of this work therefore was to establish a CD44v6-specific CAR T-cell therapy against HNSCC cells in vitro. Initially, the CD44v6 and CD44 expression patterns were analyzed in 31 primary HNSCC cell lines by flow cytometry. The cell lines showed different expressions of CD44v6 and CD44. Therefore, a cDNA for CD44v6 was stably expressed in the HNSCC cell line UT24A as a positive control. A second generation CD44v6 CAR with the scFv fragment of the monoclonal antibody BIWA8 and with the signaling chains of human CD28 and the CD3ζ-chain was stably expressed by lentiviral gene transfer in primary human T- cells and the transduced T-cells were then enriched to >90 % via a CD34-derived hinge domain using the MACS technology. To assess the cytotoxic potential of the genetically modified T-cells, they were co-cultured with HNSCC cell lines for 16 hours and then the lysis of the HNSCC cells was determined by flow cytometry or with a cell- based proliferation assay. This showed that the lysis efficiency of the genetically modified T- cells depended predominantly on the antigen density on the target cells: cell lines with higher CD44v6 expression levels (UM14C, UM11B) were already efficiently lysed at low target-to-effector cell ratios, while the naive UT24A cells with low CD44v6 expression were hardly eliminated. Lentiviral overexpression of CD44v6 then significantly increased the lysis of UT24A cells by the CAR T-cells, indicating the specificity of the CD44v6 CAR. In this work, a CD44v6-targeted CAR T-cell therapy was established, by which HNSCC cells can be efficiently eliminated in vitro in a short time period. Future approaches should better protect the CAR T-cells from the immunosuppressive tumor microenvironment of HNSCC and additionally develop combination therapies that further optimize the lysis efficiency against the malignant cells and largely circumvent toxicity against CD44v6- positive healthy tissues. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 19.06.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 19.06.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.02.2024 | |||||||
| Datum der Promotion: | 13.06.2024 |
