Dokument: Untersuchung neuer Behandlungsstrategien mittels Drugscreening für die juvenile myelomonozytäre Leukämie
| Titel: | Untersuchung neuer Behandlungsstrategien mittels Drugscreening für die juvenile myelomonozytäre Leukämie | |||||||
| Weiterer Titel: | Investigation of new treatment strategies for juvenile myelomonocytic leukemia using drug screening | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=66003 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240605-111421-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Kuhn, Lisa-Maria [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Borkhardt, Arndt [Gutachter] PD Dr. Rosenbaum, Thorsten [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die juvenile myelomonozytäre Leukämie (JMML) ist eine maligne Erkrankung der myeloischen Zellen im jungen Kindesalter mit einem gemischten Bild aus Myeloproliferation und Myelo-dysplasie. Trotz intensiver Forschung zur Pathogenese und Therapie der JMML ist die allogene Stammzelltransplantation in den meisten Fällen nach wie vor die einzige kurative Therapieop-tion. Mit einer 5-Jahres Überlebensrate von etwa 50 % ist die Prognose der betroffenen Pati-enten weiterhin fatal. In 90 % aller JMML-Erkrankungen kann eine Mutation in einem von fünf zugrundeliegenden Genen (KRAS, NRAS, PTPN11, CBL und NF1) nachgewiesen werden. Diese führt zu einer Überaktivierung des Ras-MAPKinase-Signalwegs, sodass viele Ansätze zur Etab-lierung neuer zielgerichteter Therapien auf eine Blockade eben dieses Signalwegs abzielen. Unter anderem das Fehlen geeigneter immortalisierter JMML-Zelllinien erschwert die Erfor-schung der Pathogenese sowie Medikamententestungen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mithilfe von genetisch veränderten induced pluripotent stem cells (iPSC) das Wirkstoffansprechen auf verschiedene Inhibitoren untersucht. Hierfür wurden zunächst geeignete Plasmide zur Überexpression (wildtyp, wt bzw. mutiert, mut) oder Herab-regulation (knockdown, KD) einzelner JMML-spezifischer Gene (NRAS, KRAS, PTPN11, NF1) hergestellt und in einem ersten Schritt human embryonic kidney (HEK293)-Zellen damit trans-fiziert. Durch ein Hochdurchsatzdrugscreening der HEK293-Zellen war es möglich, eine Vor-auswahl geeigneter Inhibitoren zu treffen. Inhibitoren, die in den Untersuchungen von 180 Wirkstoffen vielversprechend erschienen, wurden gezielt in einem zweiten Schritt an transdu-zierten iPSC getestet. Zur Herstellung eines JMML-Zelllinienersatzes wurden zunächst kommerziell erhältliche iPSC von einem gesunden Individuum mit den zuvor hergestellten Plasmiden transduziert. Die Ex-pression bzw. Herunterregulation der Gene wurde auf mRNA- und Proteinebene nachgewie-sen. Für die KRASmut Zelllinie verglichen mit der KRASwt Zelllinie konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene eine deutlich erhöhte Expression gezeigt werden. Dies impliziert, dass diese Mutation durch Aktivierung bestimmter Gene über die Aktivierung des Ras-MAPKinase-Signalwegs einen Vorteil für zelluläre Proliferation mit sich bringt. Gleichzeitig wurde auf mRNA-Ebene nachgewiesen, dass die transduzierten iPSC auch nach genetischer Manipulation ihr Stammzellprofil exprimieren und sich weiterhin in hämatopoetische Vorläu-ferzellen differenzieren lassen. In einem finalen Schritt wurden die erfolgreich manipulierten induzierten pluripotenten Stammzellen auf ihr Ansprechen auf verschiedene Inhibitoren im Vergleich zur gesunden Kon-trolle getestet. Für verschiedene getestete Wirkstoffe (Dovitinib, Selumetinib, Erastin, Trame-tinib, Rapamycin und Ruxolitinib) konnte kein signifikanter Unterschied der IC50 Konzentrati-onen gemessen werden. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass sowohl iPSC-KRASmut als auch iPSC-NF1KD signifikant niedrigere IC50 Konzentrationen für Azacitidin und Dasatinib hat-ten als die jeweils entsprechende Wildtyp-Variante.Juvenile myelomonocytic leukemia is a malignant disease of myeloid cells in infants with a combination of myeloproliferation and myelodysplasia. Despite intensive research on the pathogenesis and therapy of JMML, allogeneic stem cell transplantation remains the only cu-rative therapy in most cases. With a 5-year survival rate of about 50%, the prognosis of af-fected patients thus remains fatal. In 90 % of all JMML cases, a mutation in one of five under-lying genes (KRAS, NRAS, PTPN11, CBL and NF1) can be detected. This leads to overactivation of the Ras-MAPKinase pathway. Many efforts to establish new targeted therapies are aimed at blocking this certain pathway. Among other things, the lack of suitable immortalized JMML cell lines makes research into pathogenesis and drug testing difficult. In this work, genetically modified induced pluripotent stem cells (iPSC) were used to investi-gate the drug response to different inhibitors. For this purpose, suitable plasmids for the over-expression (wildtype, wt or mutation, mut) or downregulation (knockdown, KD) of individual JMML-specific genes (NRAS, KRAS, PTPN11, NF1) were produced and, in a first step, human embryonic kidney (HEK293)-293 cells were transfected with them. High-throughput drug screening of HEK293 cells allowed us to pre-select suitable inhibitors. Inhibitors that appeared promising in the screening of 180 drugs were specifically tested in a second step on transduced iPSCs. To generate a JMML-like cell line, commercially available iPSC from healthy individuals were first transduced with the previously prepared plasmids. Gene expression or downregulation was detected at the mRNA level and protein level. For the KRASmut cellline compared to the KRASwt cellline, significantly increased expression was shown at both the mRNA level and protein level. This implies that this mutation confers an advantage for cell renewal processes by activating specific genes via up-regulation of the Ras-MAPKinase pathway. At the same time, it was demonstrated at the mRNA level that the transduced iPSC continue to express their stem cell profile and differentiate into hematopoietic progenitor cells even after genetic manipulation. In a final step, the successfully manipulated induced pluripotent stem cells were tested for their response to different inhibitors compared to healthy controls. No significant difference in IC50 concentrations was measured for the most agents tested (dovitinib, selumetinib, eras-tin, trametinib, rapamycin, and ruxolitinib). Still, it was shown that both iPSC-KRASmut and iPSC-NF1KD had significantly lower IC50 concentrations for azacitidine and dasatinib than the respective wild-type variant. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 05.06.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 06.06.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 31.10.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.03.2024 |
