Dokument: Etablierung und Optimierung der sekretorischen Gewinnung von thermostabilen Lipasen in Gram-positiven Bakterien

Titel:	Etablierung und Optimierung der sekretorischen Gewinnung von thermostabilen Lipasen in Gram-positiven Bakterien
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6593
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20071219-115738-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Brundiek, Henrike [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,85 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.12.2007 / geändert 19.12.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Freudl, Roland [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter]
Stichwörter:	Gram-positive Bakterien, Proteinsekretion, Sec-Weg, Tat-Weg, thermostabile Lipasen
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Thermostabile Lipasen wie die Lipase GTL aus Geobacillus thermoleovorans IHI-91 sind biotechnologisch relevante Enzyme, die in der Feinchemie anstelle von chemischen Katalysatoren zur Umsetzung von langkettigen Fettsäuren unter hohen Temperaturen eingesetzt werden können. Um diese Enzyme mit geringen Aufarbeitungskosten zu produzieren, bietet sich die sekretorische Proteingewinnung in mesophilen Gram-positiven Bakterien an. Problem hierbei ist, dass rekombinante Proteine aufgrund einer mangelnden Anpassung an das heterologe Wirtssystem häufig nicht oder nur mit geringen Produktausbeuten im Kulturüberstand gewonnen werden können. Aus diesem Grund wurden zur Etablierung der sekretorischen Proteingewinnung der Lipase GTL, die bisher nur intrazellulär gewonnen wurde, nach dem Tool-Box-Prinzip verschiedene Gram-positive Wirtssysteme, Sekretionswege und Signalpeptide mit der Lipase GTL kombiniert. Dabei zeigte sich, dass die Lipase GTL in Staphylococcus carnosus sowohl mit ihrem eigenen Sec-Signalpeptid über den Sec-Weg als auch Tat-abhängig mit dem Signalpeptid der Escherichia coli TMAO-Reduktase (TorA) mit signifikanten Enzymausbeuten gewonnen werden kann. Dabei war die Aktivität der Lipase GTL im Kulturüberstand etwa 4-mal höher, wenn sie über den Sec-Weg in einer ungefalteten Konformation transloziert wurde als wenn sie Tat-abhängig in einer gefalteten Konformation sekretiert wurde (0,7 U/ml). Um die Tat-abhängige Sekretion der Lipase GTL in verschiedenen Gram-positiven Bakterien zu vergleichen, wurde sie in Corynebacterium glutamicum und in Bacillus subtilis mit dem E.coli TorA-Signalpeptid exprimiert. Während in B.subtilis die Expression der Lipase GTL die Zellintegrität störte und eine Zelllyse verursachte, wurde die Lipase GTL mit einer Aktivität von ca. 1,25 U/ml über das TatABC-System von C.glutamicum sekretiert. Auffällig war, dass die Überexpression der Lipase GTL in C.glutamicum zu einer Substratsättigung der Tat-Translokase führt, bei der es zu einer starken Akkumulation von aktiven Enzymspezies im Gesamtzellextrakt kommt. Da es sich hierbei um einen typischen Engpass der Tat-abhängigen Sekretion handelt, wurde er als Modellfall gewählt, um drei unabhängige Strategien zu seiner Aufhebung zu entwickeln. Bei der ersten Strategie war es das Ziel, über eine gerichtete Evolution das artfremde E.coli TorA-Signalpeptid an den Tat-Weg von C.glutamicum so anzupassen, dass die Lipase GTL mit einer erhöhten Aktivität in den Kulturüberstand sekretiert wird. Zu diesem Zweck wurden durch Zufallsmutagenese ca. 11.000 verschiedene Varianten des TorA-Signalpeptids erzeugt und mit der Lipase GTL fusioniert. Bei einem anschließenden Hochdurchsatz-Screening wurden jedoch keine C.glutamicum Transformanten mit einer signifikant erhöhten Aktivität der Lipase GTL im Kulturüberstand gefunden. Vielmehr wurden Determinanten im TorA-Signalpeptid identifiziert, die wichtig für die Funktionalität des E.coli TorA-Signalpeptids in C.glutamicum sind. Bei der zweiten Strategie war es das Ziel, durch Überexpression von homologen oder heterologen Tat-Komponenten die Translokationseffizienz der Lipase GTL zu verbessern. Während durch Coexpression von E.coli Tat-Komponenten keine funktionelle Translokation in C.glutamicum erzielt wurde, führte die Expression von homologen TatA und TatC Proteinen zu einer um den Faktor 4 verbesserten Sekretion der Lipase GTL. Dies zeigte, dass bei Überexpression der Lipase GTL die Anzahl der verfügbaren Tat-Komponenten limitierend wirkt. Als dritte Strategie wurde untersucht, ob durch Coexpression des heterologen Chaperons TorD, das spezifisch an das TorA-Signalpeptid bindet, die Sekretion der Lipase GTL über den Tat-Weg in C.glutamicum verbessert werden kann. In E.coli koordiniert dieses Chaperon während des Tat-Proofreadings die Reifung von Tat-Substraten mit deren Translokation. Während in E.coli die Coexpression von TorD zu einer verbesserten Tat-Sekretion führte, kam es in C.glutamicum zu einem vollständigen Exportblock von TorA-Vorläuferproteinen. Ursache hierfür ist, dass der Faktor, der für die Ablösung von TorD vom TorA-Signalpeptid in E.coli verantwortlich ist, in C.glutamicum fehlt. Da es sich bei diesem Faktor wahrscheinlich um Komponenten der E.coli Tat-Translokase handelt, wurden verschiedene E.coli Tat-Komponenten gemeinsam mit dem Chaperon TorD und dem Modellsubstrat TorASPGFP in C.glutamicum Wildtypzellen coexprimiert. Dabei zeigte sich, dass es nur zu einer Sekretion des Modellsubstrates kam, wenn die E.coli TatABC-Translokase gemeinsam mit TorD in C.glutamicum exprimiert wurde. Dies bedeutet, dass die E.coli TatABC-Translokase direkt am Ablöseprozess von TorD vom TorA-Signalpeptid beteiligt ist. Thermostable lipases like the lipase GTL from Geobacillus thermoleovorans IHI-91 offer great potential for biotechnological applications, as they can be used instead of chemical catalysts for the conversion of long chain fatty acids under high temperatures. A secretory production of these biotechnological, relevant enzymes in Gram-positve bacteria seems advantageous because the costs of downstream processing are low, since proteins can be purified directly from the culture supernatant. However, recombinant proteins are often secreted inefficiently in these heterologous host organisms, because they are not adapted to the secretory pathways in these bacteria. The secretory production of the lipase GTL, which was only produced intracellularly so far, was analyzed by making use of a toolbox principle, i.e. combining different Gram-positive host organisms, secretory pathways, and signal sequences with the lipase GTL. In Staphylococcus carnosus, the lipase GTL was secreted with significant enzyme yields both Sec-dependently with its authentic signal sequence and Tat-dependently as a fusion with the signal sequence of the Escherichia coli TMAO-Reductase (TorA). The activity of the lipase GTL in the supernatant was 4 times higher when it was secreted via the Sec-pathway in an unfolded conformation (2,6 U/ml) than when it was translocated via the Tat-pathway in a fully folded conformation (0,7 U/ml). In order to compare the Tat-dependent secretion of the lipase GTL in different Gram-positive bacteria, the lipase GTL was expressed as a fusion with the E.coli TorA-signal sequence also in Corynebacterium glutamicum and in Bacillus subtilis. While the expression of the precursor TorASPGTL in B.subtilis disturbed the cell integrity and caused cell lysis, the lipase GTL was secreted with a significant activity of about 1,25 U/ml via the TatABC-system of C.glutamicum. Strikingly the overexpression of the lipase GTL in C.glutamicum caused a substrate saturation of the Tat-translocase, consequently active enzyme species accumulated in the cytosol of C.glutamicum. As substrate saturation is a typical bottleneck of Tat-dependent secretion, it was chosen as a case study for testing the ability of three independent strategies to relieve this bottleneck. The objective of the first strategy was to adjust the unrelated E.coli TorA-signal sequence to the Tat-pathway in C.glutamicum in such a way that the lipase GTL is secreted with a higher efficiency into the supernatant. Therefore, about 11.000 variants of the TorA-signal sequence were generated by random mutagenesis and fused to the lipase GTL. However, no C.glutamicum transformants with significantly increased enzyme activities in the corresponding culture supernatants could be detected in a subsequent high throughput screening. Nevertheless, using this approach, several determinants were identified which are important for the functionality of the E.coli TorA-signal sequence. The aim of the second strategy was to increase the translocation effiency of lipase GTL by overexpression of homologous and heterologous Tat-components. While coexpression of E.coli Tat-components failed to produce functional Tat-translocases in C.glutamicum, the overexpression of the homologous C.glutamicum TatA and TatC proteins increased the activity of lipase GTL in the supernatant more than 3 times. This demonstrated that the number of Tat-components was a limitation for Tat-translocation under overexpression conditions of the hybrid precursor protein TorASPGTL. As a third strategy, it was examined whether the coexpression of the heterologous E.coli chaperone TorD, which specificially binds to the TorA-signal sequence, will increase the Tat-dependent secretion in C.glutamicum. This chaperone coordinates the maturation of TorA-precursor proteins during Tat-proofreading in E.coli. In contrast to E.coli, where co-overexpression of TorD results in a more efficient membrane translocation of TorA-precursor proteins, the coexpression of TorD in C.glutamicum caused surprisingly an almost complete export block of TorA-precursor proteins. A possible reason for this finding is that a special release factor for TorD, that is present in E.coli, is missing in C.glutamicum. Since such a release factor is probably a component of the E.coli Tat-translocase, different E.coli Tat-components were expressed together with the chaperone TorD and the model substrate TorASPGFP in C.glutamicum wild-type cells. As a result, it could be shown that secretion of the model substrate was only possible, if the E.coli TatABC-translocase was concommitantly coexpressed together with TorD in C.glutamicum. From this result it can be concluded, that the E.coli TatABC-translocase is directly involved in the release of the TorD chaperone from the TorA-signal sequence.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	19.12.2007
Dateien geändert am:	19.12.2007
Promotionsantrag am:	28.09.2007
Datum der Promotion:	12.11.2007