Dokument: In vitro reconstitution of the hemolysin A T1SS from uropathogenic Escherichia coli
| Titel: | In vitro reconstitution of the hemolysin A T1SS from uropathogenic Escherichia coli | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65784 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240527-113211-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Bilsing, Florestan Leander [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, Johannes [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | T1SS, ABC transporter | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Gram-negative bacteria have evolved a variety of transport and secretion systems to enable transport across one, two or three biological membranes. The secretion systems are classified into different groups numbered from type 1 onwards. The type 1 secretion system (T1SS) is a rather simple system with a translocation channel built by only three different proteins: an ATP-binding cassette (ABC) transporter, a membrane fusion protein (MFP) and an outer membrane protein (OMP). The secretion process is powered by ATP hydrolysis and allows secretion of the unfolded substrate from the cytosol to the extracellular space in one single step.
One of the best studied T1SSs is the hemolysin A (HlyA) T1SS from uropathogenic E. coli, which transports the pore forming toxin HlyA. The ABC transporter is hemolysin B (HlyB), the MFP is hemolysin D (HlyD) and the OMP is TolC. HlyB and HlyD form a so-called inner membrane complex (IMC) in the inner membrane, while TolC is located in the outer membrane. Although the HlyA T1SS is known for more than 70 years, there are still many open questions regarding its molecular organisation and mode of action. In this thesis, the establishment of the in vitro reconstitution of the HlyA T1SS is shown. Additionally, I present an in vitro transport assay which was successfully performed to serve as a first proof of principle. This in vitro set up provides a powerful tool for the future to investigate the system in further detail. The purification and reconstitution of the ABC transporter HlyB and the IMC were studied here intensively. The protocol for HlyB purification was optimized for structural studies and the reconstitution into MSP-based nanodiscs established. A protocol for reconstitution of IMC in MSP-based nanodiscs was established as well. TolC reconstituted in liposomes was used to complete the assembly in vitro. Furthermore, the ABC transporter RtxB, part of the homologous RtxA T1SS from the emerging pathogen Kingella kingae, was characterized biochemically and structurally. A purification protocol for RtxB was established that allowed initial structural analysis using cryo-EM including the construction of a 3D volume map. RtxB showed a higher basal ATPase activity in detergent than its homolog HlyB. Reconstitution into MSP-based nanodiscs increased the ATPase activity of RtxB and further stabilized the ABC transporter in vitro.Gram-negative Bakterien haben im Laufe der Zeit eine Vielzahl an Transport- und Sekretionssystemen entwickelt, welche den Transport über eine, zwei oder drei biologische Membranen ermöglichen. Die Sekretionssysteme werden in verschiedene Gruppen eingeteilt und durchnummeriert, beginnend mit Typ 1. Das Typ 1 Sekretionssystem (T1SS) hat einen vergleichsweise einfachen Aufbau mit einem Transportkanal, der aus nur drei verschiedenen Proteinen besteht: ein ATP-binding cassette (ABC) Transporter, ein Membranfusionsprotein (MFP) und ein Membranprotein der äußeren Membran (OMP). Die Sekretion wird durch Hydrolyse von ATP angetrieben und das Substrat wird im ungefalteten Zustand in einem Schritt vom Zytosol in den extrazellulären Raum sekretiert. Eines der am besten untersuchten T1SS ist das Hämolysin A (HlyA) T1SS aus uropathogenen E. coli Stämmen. Es transportiert das porenbildende Toxin HlyA. Der ABC Transporter in diesem System ist Hämolysin B (HlyB), das MFP ist Hämolysin D (HlyD) und das OMP ist TolC. HlyB und HlyD formen einen Komplex (IMC) in der inneren Membran, während sich TolC in der äußeren Membran befindet. Obwohl das HlyA T1SS seit über 70 Jahren bekannt ist, gibt es immer noch viele offene Fragen hinsichtlich seiner molekularen Organisation und dem detaillierten Ablauf des Sekretionsprozesses. In dieser Arbeit wird die Etablierung der in vitro Rekonstitution des HlyA T1SS gezeigt. Außerdem präsentiere ich einen ersten erfolgreichen in vitro Transporttest, der als Machbarkeitsnachweis dient. Das hier beschriebenen in vitro System ermöglicht in Zukunft eine noch detailliertere Untersuchung des HlyA T1SS. Die Reinigung und Rekonstitution des ABC Transporters HlyB und des IMC wurden in dieser Arbeit ausführlich untersucht. Das Reinigungsprotokoll für HlyB wurde für strukturelle Analysen optimiert und die Rekonstitution in Lipid-Nanopartikel, basierend auf dem Membrangerüst bildenden Protein (MSP), wurde etabliert. Zusätzlich wurde ein Protokoll zur Rekonstitution des IMC in MSP basierte Lipid-Nanopartikel entwickelt. Dazu wurde TolC in Liposomen rekonstituiert, um die in vitro Assemblierung zu ermöglichen. Des Weiteren wurde der ABC Transporter RtxB biochemisch und strukturell untersucht. RtxB ist Teil das homologen RtxA T1SS aus dem neu aufkommenden Erreger Kingella kingae. Ein Reinigungsprotokoll für RtxB wurde etabliert, das erste strukturelle Analysen mittels Kryo-EM bis hin zur Erstellung einer 3D Klasse ermöglichte. RtxB zeigte in Detergenz eine basale ATPase Aktivität, welche höher als die seines Homologs HlyB war. Darüber hinaus erhöhte die Rekonstitution von RtxB in MSP basierte Lipid-Nanopartikel die ATPase Aktivität und führte zu einer zusätzlichen Stabilisierung von RtxB in vitro. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 27.05.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 27.05.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 06.02.2024 | |||||||
| Datum der Promotion: | 13.03.2024 |
