Dokument: Proteolytic Antibodies – Myth or Reality? Attempts to isolate proteolytic antibodies via Proteolytic Antigen Cleavage-Mediated AmplificatioN (PACMAN)

Titel:	Proteolytic Antibodies – Myth or Reality? Attempts to isolate proteolytic antibodies via Proteolytic Antigen Cleavage-Mediated AmplificatioN (PACMAN)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65764
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240527-130651-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hasecke, Jan Filip Tristan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 50,39 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.05.2024 / geändert 14.05.2024
Beitragende:	Dr. Hoyer, Wolfgang [Gutachter] Prof.Dr. Willbold Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Proteolytische Antikörper Amyloid Beta Verdau PACMAN
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Diese Arbeit umfasst zwei Hauptthemen. Im Hauptteil präsentiere ich die Entwicklung einer neuartigen Methode namens Proteolytic Antigen Cleavage-Mediated AmplificatioN (PACMAN), welche die Isolierung proteolytischer Antikörper aus kombinatorischen Bibliotheken ermöglichen soll. Proteolytische Antikörper unterscheiden sich von herkömmlichen Antikörpern darin, dass sie die einzigartige Fähigkeit besitzen, ihr Antigen nicht nur zu erkennen und zu binden, sondern es auch enzymatisch zu spalten. Dies stellt jedoch eine Herausforderung für die Selektion dar, da proteolytische Antikörper über altbekannte Display-Methoden wie dem Phagen-Display nicht einfach erfasst werden können, da die Antikörper ihr Antigen nach initialer Bindung hydrolysieren und daraufhin wieder dissoziieren. Um diese Herausforderung zu bewältigen, habe ich die PACMAN-Methode entwickelt. Sie soll die Isolierung antigen-spezifischer proteolytischer Antikörper aus kombinatorischen Bibliotheken ermöglichen, indem die Mikrobead-gebundene DNA einzelner Bibliotheksvarianten in pikolitergroßen Wasser-in-Öl-Emulsionen in vitro exprimiert wird und anschließend Mikrobeads mit aktiven Bibliotheksvarianten mittels Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) detektiert und isoliert werden, falls diese erfolgreich zusätzlich an die Mikrobeads gebundene, doppelt fluoreszent markierte Antigen-Substrate gespalten haben, welche als Reporter dienen. In dieser Arbeit wurde das Prinzip von PACMAN erfolgreich validiert, indem DNA, welche die Tabakmosaikvirus-Protease kodiert, aus einer verdünnten Mischung mit überschüssiger, irrelevanter DNA zurückgewonnen wurde. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Untersuchung der Bildung von Amyloid-β-Oligomeren (AβO) und deren pathophysiologischen Auswirkungen bei der Alzheimer-Krankheit. Das „dimAβ”-Modell, das metastabile AβO bildet, wurde verwendet, um den Einfluss von AβO auf die Fibrillenaggregation, die Biogenese von AβO und ihre Auswirkungen auf neuronale Prozesse selektiv zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass AβO unabhängig von der Fibrillenbildung entstehen und zusätzlich die Proliferation von bestehenden Amyloid-Fibrillen aktiv behindern. Darüberhinaus wurde ein potenzieller in vivo Entstehungsweg von AβO entdeckt. Ein leicht saurer pH-Wert von 4,5–5,5, der physiologisch in endolysosomalen Vesikeln vorkommt, beschleunigte die Bildung von AβO durch Aβ42 um etwa das 8.000-fache. Unter diesen Bedingungen wurde die kritische Aβ42-Konzentration, welche für die Bildung von AβO erforderlich ist, auf ca. 3 μM verringert. Diese Konzentration wurde in endolysosomalen Vesikeln bereits nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das endolysosomale System möglicherweise einen wichtigen Ort für die in vivo Bildung von toxischen AβO darstellt. Schließlich wurde der spezifische Einfluss von AβO auf primäre Mausneuronen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass AβO an dendritischen Spines binden können und dass Neurone, die AβO ausgesetzt wurden, verringerte spontane Ca2+ -Oszillationen aufwiesen. Am interessantesten war allerdings, dass eine deutliche Translokation des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau von den Axonen der Neurone in ihre somatodendritischen Kompartimente stattfand. Diese Translokation von Tau ist als ein entscheidendes Ereignis während der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit bekannt. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit die Entwicklung der PACMAN-Methode, sowie eine eingehende Untersuchung von AβO und ihrer Rolle im Bezug auf die Alzheimer-Krankheit. Dabei liefert die PACMAN-Methode einen vielversprechenden Ansatz zur Isolation proteolytischer Antikörper gegen Amyloide aus kombinatorischen Bibliotheken, während die gewonnenen Erkenntnisse über die Bildung von AβO und ihre Auswirkungen auf die Fibrillenaggregation und ihr Einfluss auf neuronale Prozesse zu einem tieferen Verständnis der zugrunde liegenden Pathologie der Alzheimer-Krankheit beitragen. This thesis encompasses two key topics. As the prime topic, I present the development of a novel method called Proteolytic Antigen Cleavage-Mediated Amplifi- catioN (PACMAN) which aims to enable the isolation of proteolytic antibodies from combinatorial libraries. Proteolytic antibodies differ from conventional antibodies as they possess the unique ability to not only recognize and bind their antigen, but also enzymatically cleave it. However, this adds to the challenge that proteolytic antibodies fail to be effectively captured via well-known display methods, such as phage display, as the antibodies hydrolyze their antigen upon binding, leading to dissociation of the binding complex. To address this challenge, I invented the PACMAN method. It aims to allow the isolation of antigen-specific proteolytic antibodies from combinatorial libraries by in vitro expression of microbead-bound DNA of individual library members in picoliter-sized water-in-oil emulsions and subsequent detection and recovery of microbeads carrying DNA of active library members via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the successful cleavage of a simultaneously microbead-bound dual fluorescent labeled antigen-substrate as a reporter. In this thesis, the principle of PACMAN was successfully validated by recovery of DNA encoding Tobacco-Etch-Virus protease from a dilute mixture with excess irrelevant DNA. The second focus of this thesis is an investigation into the formation and pathophysiological implications of amyloid-β oligomers (AβO) in Alzheimer’s disease. The ’dimAβ’ model, which forms metastable AβO, was leveraged to selectively examine the influence of AβO on fibril aggregation, AβO biogenesis and their impact on neuronal processes. It was demonstrated that AβO form independent from fibril formation and actively hinder the proliferation of amyloid fibrils. Furthermore, a potential in vivo pathway for AβO generation was discovered. A slightly acidic pH of 4.5–5.5, which is physiologically present in endolysosomal vesicles, accelerated AβO formation by Aβ42 approximately ∼8,000-fold. Under these conditions, the critical Aβ42 concentration necessary for AβO formation was decreased to ∼3 μM, which was shown to be present in endolysosomal vesicles. These findings indicate that the endolysosomal system might be an important site for toxic AβO generation in vivo. Lastly, the specific impact of AβOs on primary mouse neurons was examined. The results revealed that AβO prominently bind to dendritic spines while neurons exposed to AβO stimuli exhibited decreased spontaneous Ca2+ -oscillations and translocation of the microtubule-associated protein tau from their axons to their somatodendritic compartments. This translocation of tau is known as a critical event implicated in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. In conclusion, this thesis presents the development of the PACMAN method, along with an in-depth investigation into AβO and their role in Alzheimer’s disease. The PACMAN method offers a promising approach for the isolation of proteolytic antibodies from combinatorial libraries against amyloid targets, while the insights gained into AβO formation and their impact on fibril aggregation and neuronal processes contribute to a deeper understanding of the underlying pathology of Alzheimer’s disease.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	27.05.2024
Dateien geändert am:	27.05.2024
Promotionsantrag am:	24.08.2023
Datum der Promotion:	22.03.2024